RNAi TRAF4表達(dá)對(duì)直腸癌細(xì)胞凋亡及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

[摘要]目的探討RNA干擾（RNAi）腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（TRAF4）表達(dá)對(duì)直腸癌細(xì)胞凋亡及wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法將TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染人直腸癌sw1463細(xì)胞（TRAF4-siRNA組），并設(shè)置陰性對(duì)照組（NC組）及空白組。收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)3組細(xì)胞中TRAF4的蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率及活性氧簇（ROS）含量，western blotting檢測(cè)凋亡蛋白survivin、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）的蛋白表達(dá)。結(jié)果TRAF4-siRNA組TRAF4的蛋白表達(dá)顯著低于空白組（t=7.926，P<0.05），NC組TRAF4蛋白表達(dá)與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.634，P>0.05）；與空白組比較，TRAF4-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=14.992，P<0.05），ROS含量顯著上升（t=5.717，P<0.05），survivin、β-catenin和cyclin D1的蛋白表達(dá)顯著降低（t=5.437～9.344，P<0.05），Bax的蛋白表達(dá)顯著升高（t=7.399，P<0.05）。結(jié)論抑制直腸癌細(xì)胞中TRAF4基因表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及下調(diào)wnt信號(hào)通路。

[關(guān)鍵詞]直腸腫瘤；TNF受體相關(guān)因子4；RNA干擾；細(xì)胞凋亡；Wnt信號(hào)通路

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率逐漸上升并呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類生命健康。目前已發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等涉及多個(gè)基因的變化，如腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23、癌基因C-myc、抑癌基因p53等，但由于其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，因此仍需尋找新的分子標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（TRAF4）基因定位于染色體17q11-12，是TRAF家族成員之一，參與腫瘤調(diào)控。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4在肺癌、乳癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)。研究也顯示，TRAF4基因沉默可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，但TRAF4對(duì)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響及具體機(jī)制尚未清楚。因此，本研究通過(guò)RNA干擾（RNAi）抑制直腸癌細(xì)胞中TRAF4的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，并進(jìn)一步分析探討其可能的分子機(jī)制，為直腸癌的分子靶向治療提供參考。

1材料和方法

1.1材料

人直腸癌SWl463細(xì)胞株購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室；胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；LipofectamineTM2000、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）/碘化丙錠（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒及流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司；TRAF4、survivin、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及其培養(yǎng)

從液氮罐中取出SW1463細(xì)胞，復(fù)溫后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO₂培養(yǎng)箱中，用RPMI 1640培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清及青霉素一鏈霉素雙抗）培養(yǎng)，按時(shí)進(jìn)行傳代、換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2分組及siRNA轉(zhuǎn)染

本實(shí)驗(yàn)將SWl463細(xì)胞分為3組，即空白組（A組）、陰性對(duì)照組（NC組，B組）和TRAF4-siRNA組（C組）。空白組細(xì)胞無(wú)特殊處理，NC組和TRAF4-siRNA組分別轉(zhuǎn)染對(duì)TRAF4表達(dá)沒(méi)有干擾作用的和具有干擾作用的siRNA。轉(zhuǎn)染前1d將SWl463細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)融合度在60%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明操作，收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)細(xì)胞TRAF4表達(dá)影響

在SWl463細(xì)胞中加入適量裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法對(duì)蛋白定量，根據(jù)待測(cè)蛋白要求制備膠，每泳道上樣50μg蛋白行SDS-PAGE電泳分離，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。使用50 g/L脫脂奶粉封閉后4℃孵育一抗過(guò)夜，TRAF4及內(nèi)參GAPDH抗體分別按照1：500和1：1000稀釋；洗膜，加入1：10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗常溫孵育1h；洗膜，加人ECL工作液顯色，凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)SW1463細(xì)胞凋亡的影響收集轉(zhuǎn)染48h的3組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，使用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后再分別加人5μL的Annexin V-FITC和5μL的PI，混合均勻后室溫避光環(huán)境孵育15min；1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察各組細(xì)胞的凋亡百分比。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)SW1463細(xì)胞中ROS含量的影響

采用熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素黃二乙酸酯（DCFH-DA），通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS含量。各組細(xì)胞通過(guò)磷酸鹽緩沖液洗滌，胰酶消化后離心，棄掉上清，加入DCFH-DA應(yīng)用液1mL重懸細(xì)胞，37℃避光反應(yīng)30 min。離心，再次棄掉上清，加入磷酸鹽緩沖液1 mL重懸細(xì)胞，重復(fù)此操作2次，重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其中發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。由于熒光強(qiáng)度與ROS水平呈現(xiàn)正相關(guān)，因此可以用熒光強(qiáng)度間接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6凋亡蛋白及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)通過(guò)Western bloting檢測(cè)凋亡蛋白survivin、Bax和Wnt信號(hào)通路蛋白β-catenin和cyclin D1的表達(dá)，方法參照1.2.3。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)SW1463細(xì)胞TRAF4表達(dá)影響

空白組、NC組和TRAF4-siRNA組TRAF4的蛋白表達(dá)分別為0.323±0.035、0.339±0.038和0.123±0.014，3組細(xì)胞TRAF4的蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.504，P<0.05）。TRAF4-siRNA組TRAF4的蛋白表達(dá)顯著低于空白組（t=7.926，P<0.05），NC組TRAF4的蛋白表達(dá)與空白組比較差異無(wú)顯著性（t=0.634，P>0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)SWl463細(xì)胞凋亡影響

空白組、NC組和TRAF4-siRNA組的細(xì)胞凋亡率分別為（2.13±0.28）%、（2.04±0.23）%和（9.78±1.02）%，3組間細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=151.624，P<0.05）。與空白組相比較，TRAF4-siRNA組的細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有顯著性（t=14.992，P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)SW1463細(xì)胞ROS含量影響

空白組、NC組和TRAF4-siRNA組的ROS含量分別為77.18±5.35、73.49±5.02和104.47±6.98，3組ROS含量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.133，P<0.05）。與空白組比較，TRAF4-siRNA組的ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.717，P<0.05）。

2.4轉(zhuǎn)染TRAF4-siRNA對(duì)SW1463細(xì)胞凋亡蛋白及Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，3組survivin、Bax、β-catenin、cyclin D1的蛋白表達(dá)相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.055～61.287，P<0.05）。與空白組相比較，TRAF4-siRNA組survivin、β-catenin和cyclin D1的蛋白表達(dá)均顯著降低（t=5.437～9.344，P<0.05），Bax的表達(dá)顯著升高（t=7.399，P<0.05）。見(jiàn)表1、圖3。

3討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的過(guò)程，目前用于該病的分子靶向治療已成為研究熱點(diǎn)。尋找有效的結(jié)直腸癌分子治療靶點(diǎn)，對(duì)于該病的治療具有重要意義。TRAF是一類重要的胞質(zhì)銜接蛋白，主要參與腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的信號(hào)傳導(dǎo)，TRAF4是TRAF家族中的一員，在多種腫瘤組織及細(xì)胞中出現(xiàn)異常高表達(dá)。在多種惡性腫瘤中改變TRAF4的表達(dá)水平可影響其惡性表型。如果靶向抑制食管癌細(xì)胞中TRAF4表達(dá)可降低細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期于G/G期；TRAF4表達(dá)的沉默可在體內(nèi)及體外抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)；抑制TRAF4表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及克隆形成能力。TRAF4對(duì)直腸癌細(xì)胞的凋亡及具體機(jī)制還未清楚。

RNAi是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因阻斷技術(shù)，是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的使特異mRNA序列降解的現(xiàn)象，具有高效性、特異性等特點(diǎn)，是目前研究基因功能有效的途徑。本研究通過(guò)RNAi技術(shù)沉默直腸癌SWl463細(xì)胞TRAF4基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TRAF4的表達(dá)受到抑制后SWl463細(xì)胞的凋亡率顯著升高。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡過(guò)程，受到氧化應(yīng)激及多種基因的影響。研究發(fā)現(xiàn)，ROS的過(guò)量產(chǎn)生可引起細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，破壞核酸，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，ROS可誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。Survivin為凋亡蛋白抑制因子IAP家族中的一員，在多種腫瘤中表達(dá)升高，結(jié)直腸癌中survivin高表達(dá)病人5年生存率比低表達(dá)者低。Bax是Bcl-2家族成員之一，為促凋亡蛋白，其表達(dá)水平升高可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中Bax水平降低。為探討TRAF4如何調(diào)控SWl463細(xì)胞凋亡，本研究檢測(cè)抑制TRAF4表達(dá)后細(xì)胞中ROS含量及survivin和Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，ROS含量和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，sur-vivin表達(dá)顯著降低。這提示TRAF4可通過(guò)調(diào)節(jié)ROS含量及survivin和Bax的表達(dá)誘導(dǎo)SW1463細(xì)胞凋亡。Wnt信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守，可對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等進(jìn)行調(diào)控，在多種腫瘤中處于激活狀態(tài)，其異常激活可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡起抑制作用，抑制Wnt信號(hào)通路可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRAF4可通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)影響口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及侵襲過(guò)程。TRAF4是否可調(diào)控Wnt信號(hào)影響結(jié)直腸癌凋亡還不清楚。本研究抑制TRAF4表達(dá)后檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子β-catenin和cyc-lin D1的表達(dá)，結(jié)果顯示，抑制TRAF4表達(dá)后β-catenin和cyclin D1的表達(dá)均顯著降低。

綜上所述，抑制直腸癌細(xì)胞中TRAF4基因表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及下調(diào)Wnt信號(hào)通路，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑可能是通過(guò)提高ROS含量、上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)survivin表達(dá)。本研究提示TRAF4可能是直腸癌治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入探討其在直腸癌中的作用。