高尿酸血癥致糖尿病大鼠模型構(gòu)建方法研究

[摘要]目的擬建立一種高尿酸血癥致糖尿病的典型動(dòng)物模型。方法

選取70只12周齡Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（A組，30只）和模型組（B組，40只）。A組大鼠給予普通飲食，蒸餾水灌胃。B組大鼠飲食分兩個(gè)階段：第一階段，飼喂高酵母飼料，腺嘌呤溶液（100 mg·kg^-1·d^-1）灌胃；在大鼠血尿酸（SUA）水平顯著下降時(shí)進(jìn)人第二階段，此階段繼續(xù)喂食高酵母飼料，但灌胃的腺嘌呤溶液劑量改為50 mg·kg^-1·d^-1，同時(shí)給予氧嗪酸鉀皮下注射。實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)大鼠SUA、血糖、胰島素等相關(guān)生化指標(biāo)，觀察并記錄大鼠的進(jìn)食和排泄情況、體質(zhì)量變化及精神狀態(tài)。結(jié)果與A組相比，B組大鼠自建模第2周起SUA水平明顯升高（t=4.92～16.24，P<0.05）；B組大鼠空腹胰島素及葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）2 h胰島素水平隨SUA的升高而降低，與A組相比，均自第3周起顯現(xiàn)出持續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=2.679～12.904，Pd0.05）；與A組相比，B組大鼠空腹血糖及OGTT 2 h血糖水平升高，自第10周起表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=2.910～13.539，P<0.05）。自第9周起，B組大鼠表現(xiàn)出典型的糖尿病臨床癥狀：多尿、多飲、消瘦、精神萎靡、活動(dòng)減少。結(jié)論造模大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)與臨床癥狀相符，表明高尿酸血癥致糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。

[關(guān)鍵詞]高尿酸血癥；糖尿病，2型；模型，動(dòng)物作用。荷蘭鹿特丹大學(xué)的一項(xiàng)研究指出，超過(guò)1/4的糖尿病發(fā)病因素可以歸結(jié)為高水平的SUA。還有研究表明，高尿酸血癥合并糖尿病病人心腦血管疾病、腎結(jié)石和痛風(fēng)等疾病的發(fā)病率更高，兩種病癥的合并會(huì)加速相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程。鑒于高尿酸血癥合并糖尿病給人們健康帶來(lái)一系列危害，尋求一種典型動(dòng)物模型以了解其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制變得尤為迫切。本研究擬建立一種高尿酸血癥致糖尿病的典型動(dòng)物模型，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物

雌性Wistar大鼠（12周齡）由青島市藥品檢驗(yàn)所提供。

1.1.2儀器

大鼠葡萄糖鉗夾專用代謝籠，血糖儀，BIOSEN C-LINE葡萄糖/乳酸分析儀，HAR-VARD微量注射泵，SYEMEX CHEMIX2180型全自動(dòng)生化分析儀。

1.1.3試劑

葡萄糖，腺嘌呤，酵母粉，羧甲基纖維素鈉粉，氧嗪酸鉀，生理鹽水，胰島素放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），一抗（兔抗大鼠胰島素抗體，Cell signal公司），二抗（羊抗兔IgG，PV-6001）、體積分?jǐn)?shù)0.10正常山羊血清和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.2動(dòng)物飼料及各類溶液制備

高酵母飼料制備：將酵母粉均勻拌入粉碎的大鼠顆粒飼料中重新壓粒成型，控制酵母粉在飼料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10。300 g/L葡萄糖溶液制備：取葡萄糖粉75 g，加蒸餾水定容至250 mL，加熱溶解為清亮液體。腺嘌呤溶液制備：腺嘌呤以蒸餾水溶解成40 g/L的懸濁液，置4℃冰箱備用。氧嗪酸鉀溶液制備：先將羧甲基纖維素鈉粉劑以生理鹽水配成8 g/L的乳狀液，再用該溶液配制25 g/L的氧嗪酸鉀生理鹽水乳懸液，置4℃冰箱備用。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及飲食方案

將70只Wistar大鼠隨機(jī)分為2組。對(duì)照組（A組）30只，飼以普通大鼠飼料，并給予同體積蒸餾水灌胃。模型組（B組）40只，飲食分兩個(gè)階段：第一階段，飼喂高酵母飼料，并以40 g/L的腺嘌呤溶液按照100 mg·kg^-1·d^-1的劑量灌胃；在監(jiān)測(cè)到大鼠SUA水平顯著下降時(shí)（通常在建模的第7～8周時(shí)），進(jìn)入第二階段，此階段繼續(xù)喂食高酵母飼料，但灌胃的腺嘌呤溶液劑量減為50 mg·kg^-1·d^-1，同時(shí)給予氧嗪酸鉀乳懸液100 mg·kg^-1·d^-1腹部皮下注射2次（早8：00時(shí)和晚20：00時(shí)）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)15周。

1.4高尿酸血癥和糖尿病相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1高尿酸血癥相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)

自飼喂第1天起，每隔1周，采集大鼠內(nèi)眥靜脈血，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定SUA、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）。生化指標(biāo)測(cè)定前，大鼠均隔夜禁食14 h。

1.4.2糖尿病相關(guān)臨床及生化指標(biāo)檢測(cè)

①臨床癥狀觀察：實(shí)驗(yàn)期間觀察記錄兩組大鼠的進(jìn)食和排泄情況、體質(zhì)量變化及精神狀態(tài)。②空腹血糖及空腹胰島素測(cè)定：以剪尾法采血5～10μL，應(yīng)用血糖儀測(cè)定空腹血糖；內(nèi)眥靜脈采血，應(yīng)用胰島素放射免疫分析試劑盒測(cè)定空腹胰島素。每組隨機(jī)選取10只大鼠測(cè)量，結(jié)果取其平均值。③葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）2 h血糖和OGTT 2 h胰島素測(cè)定：以300 g/L葡萄糖溶液按照2 g/kg體質(zhì)量的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，葡萄糖負(fù)荷后2 h，以剪尾法采血5～10μL，用血糖儀測(cè)定OGTT 2 h血糖；內(nèi)眥靜脈采血，用胰島素放射免疫分析試劑盒測(cè)定OGTT2 h胰島素。每組隨機(jī)選取10只大鼠測(cè)量，結(jié)果取平均值。④葡萄糖輸注率（GIR）測(cè)定：分別于建模的第2、6、10、13周從每組中隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行高胰島素一正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，計(jì)算GIR。

1.5大鼠胰腺組織學(xué)觀察

在建模第10周（兩組血糖水平有明顯差異）時(shí)，選取各組中的部分大鼠禁食12 h后處死，取其胰腺，用40 g/L中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，行免疫組化染色，光鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用￡檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1高尿酸血癥相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)

在建模第2周，B組大鼠SUA水平開(kāi)始顯著升高，在建模第7周時(shí)出現(xiàn)明顯回落，但在改變飼喂方式之后，SUA水平又再次迅速升高，恢復(fù)至下降前水平。自建模第2周起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，B組大鼠SUA水平一直高于A組，差異具有顯著意義（t=4.92～16.24，P<0.05）。見(jiàn)圖1。在高尿酸血癥建模成功的第1周（即建模的第2周）和第8周（即建模的第9周），兩組大鼠的TC、BUN、CRE差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.530～12.232，P<0.05），而TG差異無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)表1、2。

2.2糖尿病相關(guān)臨床及生化指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1臨床癥狀

與A組大鼠相比，自建模第9周起，B組大鼠表現(xiàn)出明顯的典型糖尿病臨床癥狀：多尿、多飲、消瘦、精神萎靡、活動(dòng)減少。

2.2.2空腹血糖和空腹胰島素

與A組相比，B組大鼠空腹血糖水平自建模第9周起出現(xiàn)持續(xù)性升高，自第10周起表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=2.910～12.806，P<0.05）。在高尿酸血癥建模成功的初期，B組大鼠的空腹胰島素水平即較A組大鼠出現(xiàn)顯著降低，且這種差異一直穩(wěn)定維持至末次檢測(cè)（t=2.679～12.904，P<0.05）。見(jiàn)圖2、3。

2.2.3OGTT 2 h血糖和胰島素

A組和B組大鼠OGTT 2 h血糖的變化趨勢(shì)與各自空腹血糖的變化趨勢(shì)基本一致。同樣，兩組大鼠OGTT 2 h胰島素的變化趨勢(shì)與各自空腹胰島素的變化趨勢(shì)也基本一致。見(jiàn)圖4、5。

2.2.4 GIR建模第2、6、10、13周時(shí)，B組大鼠的GIR顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.010～7.330，P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3胰腺組織學(xué)觀察

建模第10周時(shí)，與A組相比，B組胰島形狀變的不規(guī)則，數(shù)目明顯減少，邊緣模糊，周圍腺管細(xì)胞腫脹，間隔變小。

3討論

高質(zhì)量的動(dòng)物模型是揭示疾病病理發(fā)展、明確相關(guān)代謝相互作用機(jī)制的基礎(chǔ)，也是后期開(kāi)發(fā)驗(yàn)證治療藥物所必需的。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于2型糖尿病動(dòng)物模型的建立方法主要分為兩類：一是采用有糖尿病遺傳傾向的近交系純種動(dòng)物，如Wistar肥胖大鼠或C57BL KS糖尿病小鼠等；二是利用化學(xué)制劑誘導(dǎo)法（主要為大劑量鏈脲佐菌素）。其中，前者受限于動(dòng)物來(lái)源和嚴(yán)格的飼養(yǎng)條件，且遺傳因素在發(fā)病過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)作用，忽視了環(huán)境因素如飲食、肥胖在2型糖尿病發(fā)病中所發(fā)揮的作用；后者雖能顯著破壞胰島13細(xì)胞，達(dá)到胰島素分泌減少、血糖升高的效果，但其作用機(jī)制與普通2型糖尿病的致病機(jī)制卻不相同。有研究利用高果糖飲食誘發(fā)大鼠SUA、TG、糖代謝交互紊亂，但造模需要果糖，模型制備成本較高，且SUA、血糖升高都不甚明顯。

胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病的主要病理基礎(chǔ)和顯著特征。因此，理想的高尿酸血癥合并2型糖尿病動(dòng)物模型應(yīng)同時(shí)具備上述兩個(gè)特征。為此，本課題組開(kāi)創(chuàng)性地將構(gòu)建高尿酸血癥合并糖尿病動(dòng)物模型方法劃分為兩個(gè)造模階段。第一階段用高酵母飼料喂養(yǎng)并佐以腺嘌呤溶液灌胃，具體用量是權(quán)衡了以往各類建模藥物及飼喂方法的利弊，并結(jié)合課題前期實(shí)驗(yàn)獲得的經(jīng)驗(yàn)和結(jié)果所做出的選擇。此階段的飼喂方法可以在較短的時(shí)間內(nèi)（10 d左右）使大鼠迅速地建立起高SUA水平的狀態(tài)，并能夠使大鼠以良好的精神狀態(tài)穩(wěn)定維持高SUA水平較長(zhǎng)時(shí)間（6周左右）。這些現(xiàn)象能夠良好地匹配慢性高尿酸血癥病人的病理進(jìn)程——即在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)維持一種高尿酸血癥狀態(tài)而并未引起明顯毒副作用或其他類疾病。另外，值得注意的是，在高尿酸血癥模型建模的第7周時(shí)，B組大鼠SUA水平出現(xiàn)了顯著回落。推測(cè)是由于大鼠存在尿酸酶基因，長(zhǎng)期的高尿酸環(huán)境激活了體內(nèi)尿酸酶基因的表達(dá)。由此可以看出大鼠作為實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)模型動(dòng)物，用于建構(gòu)高尿酸血癥模型的一個(gè)不利因素——尿酸酶會(huì)阻礙大鼠模型長(zhǎng)時(shí)間維持高水平SUA狀態(tài)。故本課題組在造模第二階段引入氧嗪酸鉀。氧嗪酸鉀作為體內(nèi)尿酸酶的抑制劑用于制備高尿酸血癥動(dòng)物模型在國(guó)際上已得到普遍應(yīng)用，但一般用于短期造模。考慮到本次實(shí)驗(yàn)較長(zhǎng)的造模周期，課題組將氧嗪酸鉀改為每天2次皮下注射?？紤]到腺嘌呤具有一定毒性，長(zhǎng)期大劑量使用對(duì)腎臟損害較大，較低劑量腺嘌呤配合氧嗪酸鉀能夠保證尿酸升高同時(shí)對(duì)腎功能破壞更輕，與臨床原發(fā)高尿酸血癥更為相似，因此我們?cè)谠炷５牡诙A段將腺嘌呤劑量改為奚九一等推薦劑量的一半。在飼喂方式改變后，B組大鼠又迅速恢復(fù)高SUA水平，并維持至15周以后，且前后兩個(gè)階段大鼠SUA水平差異無(wú)顯著性，這表明此高尿酸血癥模型在包括第二造模階段的整個(gè)造模周期內(nèi)均處于一個(gè)較為恒定的高SUA狀態(tài)。建模成功第1周和第8周的TC、BUN、CRE血生化指標(biāo)結(jié)果表明，糖尿病部分病理特征在建模初期已經(jīng)顯現(xiàn)，并在之后的造模階段維持此狀態(tài)?？崭挂葝u素、OGTT 2 h胰島素和GIR的結(jié)果亦表明，在建模初期B組大鼠已表現(xiàn)出糖尿病的相關(guān)病理特征，且同樣維持了整個(gè)造模周期。空腹血糖與OGTT 2 h血糖直至高尿酸血癥建模成功后第9周時(shí)才開(kāi)始表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。這符合由高尿酸血癥引起的糖代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展順序，即首先出現(xiàn)胰島素水平的下降，進(jìn)而逐漸導(dǎo)致血糖異常。

本文結(jié)果顯示，B組大鼠空腹胰島素及OGTT2 h胰島素在建模第3周時(shí)與A組相比開(kāi)始有持續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此時(shí)B組胰島素水平下降考慮與高尿酸血癥抑制胰島素的分泌有關(guān)。ROCIC等研究指出，尿酸及其鹽類刺激胰島β細(xì)胞后，短期內(nèi)并不能影響胰島β細(xì)胞的活力及胰島素的合成，而是損傷了胰島素分泌環(huán)節(jié)的刺激一分泌耦聯(lián)通路導(dǎo)致胰島素水平下降。而實(shí)驗(yàn)后期B組大鼠空腹血糖及OGTT 2 h血糖水平明顯升高，則推測(cè)是由于持續(xù)的高尿酸血癥促使尿酸鹽結(jié)晶在胰島β細(xì)胞中沉積，又合并有前期某種機(jī)制引起的胰島素敏感性降低引發(fā)胰島β細(xì)胞代償性分泌，兩者共同作用，胰島J3細(xì)胞功能發(fā)生衰竭，最后導(dǎo)致胰島素合成減少。在建模第10周時(shí)對(duì)胰腺組織的免疫組化染色觀察也證實(shí)了這點(diǎn)。

綜上所述，兩個(gè)階段的造模程序?qū)τ趶?fù)制糖尿病在胰島素和血糖兩個(gè)方面的病理狀態(tài)是準(zhǔn)確且穩(wěn)定有效的，表明以持續(xù)高水平SUA狀態(tài)為基礎(chǔ)，構(gòu)建高尿酸血癥合并糖尿病動(dòng)物模型的建模方法是切實(shí)可行的。經(jīng)此方法構(gòu)建的大鼠模型具備以下特征：①SUA升高；②多尿、多飲、消瘦；③空腹血糖水平升高，空腹胰島素降低；④OGTT 2 h血糖水平升高，OGTT 2 h胰島素水平降低；⑤胰島素敏感性下降；⑥胰腺結(jié)構(gòu)的病變。近幾年的研究表明，高尿酸血癥與糖尿病共有一系列的危險(xiǎn)因素，兩者之間存在著一種較為復(fù)雜的間接相互作用機(jī)制。隨著對(duì)兩種疾病系統(tǒng)性認(rèn)識(shí)的深入，更多彼此間的相互關(guān)系將會(huì)被理清，此類動(dòng)物模型及相關(guān)造模方法必定有更大的發(fā)展和應(yīng)用空間。