人參多糖通過cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路抗糖尿病腎病腎纖維化作用機(jī)制研究

黃 倩，張素萍，施子祿

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，福建 泉州 362100；2.浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理系，浙江 杭州 310058；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 泉州 362000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，一旦出現(xiàn)腎纖維化，治療相當(dāng)棘手。DN的主要病理表現(xiàn)為腎小球系膜和腎小管間質(zhì)出現(xiàn)漸進(jìn)性的細(xì)胞外基質(zhì)集聚，最終導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的纖維化。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)過度表達(dá)與腎纖維化密切相關(guān)。近年的研究從多角度、多層次證實(shí)了經(jīng)典TGF-β/Smad信號(hào)通路參與腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展[1-2]。然而，TGF-β也能激活絲裂原活化蛋白激酶[3]和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)等其他信號(hào)分子，而激活環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)/PKA信號(hào)通路，可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)[4]。PKA也稱cAMP依賴的蛋白激酶，由2個(gè)調(diào)節(jié)亞基和2個(gè)催化亞基構(gòu)成。cAMP與PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié)合可促進(jìn)催化亞基的活化，有活性的催化亞基直接轉(zhuǎn)位入核，調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，如環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)家族，PKA通過催化CREB磷酸化而啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。研究顯示[5]，PKA信號(hào)通路與TGF-β誘導(dǎo)的腎小球硬化密切相關(guān)，抑制PKA/CREB信號(hào)通路能直接阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球硬化。因此，延緩或阻斷腎臟細(xì)胞外基質(zhì)過度纖維化是防治腎損害的關(guān)鍵所在，也是腎臟病治療學(xué)的一個(gè)重要課題。本研究從阻斷cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路的角度出發(fā)，積極開發(fā)抑制腎纖維化的DN防治藥物可能是一種新思路。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖類化合物如地黃多糖、黃芪多糖對(duì)DN具有良好的保護(hù)作用，而其發(fā)揮藥理作用的機(jī)制之一正是通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多種關(guān)鍵蛋白和基因如TGF-β、PKA等來實(shí)現(xiàn)[6-7]。人參PanaxginsengC.A.Mey.作為最古老、最著名的珍貴藥材之一，在我國(guó)已被廣泛應(yīng)用了數(shù)千年，其含有豐富的多糖、皂苷、多肽等化學(xué)成分。研究顯示[8]，人參多糖(ginseng polysaccharides，WGP)具有良好的抗腫瘤、抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性[8]。那么，同樣含有多糖類成分的WGP是否對(duì)DN也具有同樣的藥理作用，目前國(guó)外內(nèi)尚未見報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建DN小鼠模型，觀察WGP對(duì)DN小鼠血糖、腎功能、腎臟病理變化的影響，并對(duì)與腎纖維化相關(guān)的cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行測(cè)定，闡明WGP對(duì)腎纖維化的防治作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)有效的DN防治藥物提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年♂C57BL/6小鼠，8～12周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量23～26 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK滬2007-0005。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，自由獲取食物和水，室溫控制在22℃左右，相對(duì)濕度為30%～70%。

1.2藥物取1 kg人參粉末，按一定比例(1 ∶20)加入雙蒸水，充分混勻后，置于100℃恒溫水浴箱中水浴2 h，過濾，重復(fù)上述步驟3次，得到濾液，并用微波真空干燥器濃縮，所得濃縮液中加入5倍量的無水乙醇，4℃冰箱過夜，用布式漏斗進(jìn)行抽濾，醇沉3次，所得沉淀物即為人參粗多糖[9]。將多糖粗品配制成10 g·L-1的溶液，按3 ∶1比例加入Sevage試劑(氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1)，經(jīng)多次萃取后除去蛋白質(zhì)，用布氏漏斗抽濾得到多糖沉淀，真空干燥得到WGP，經(jīng)紅外光譜分析法鑒定多糖，紫外光譜測(cè)定樣品中的WGP純度達(dá)86.1%。

1.3試劑與儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào) S0130)；cAMP放射免疫分析藥盒(上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室，批號(hào) 20070411)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、PKA、CREB、p-CREB蛋白抗體(Abcam公司，批號(hào)分別為 ab5694、ab11575、ab2413、ab65013、ab7540、ab32096)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào) A0208)。UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)(日本島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)；5810R高速冷凍式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；XR210全自動(dòng)生化分析儀(廣東中山新銳醫(yī)療設(shè)備科技有限公司)；MDF-U3386S -80 ℃超低溫冰箱(日本三洋公司)；垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Tanon 3500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1糖尿病模型的建立及動(dòng)物分組 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，造模前12 h小鼠禁食不禁水，單次尾靜脈注射STZ(120 mg·kg-1)構(gòu)建糖尿病小鼠模型。72 h后禁食6 h，剪尾取血測(cè)空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG≥16.7 mmol·L-1為糖尿病模型成功[10]。隨機(jī)分為模型組、WGP(25、50、100 mg·kg-1)[11]組，每組10只，另設(shè)空白對(duì)照組小鼠10只，每天灌胃給藥，連續(xù)12周?？瞻讓?duì)照組和模型組給予等量等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島素，12周末無小鼠死亡。

1.4.2空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血清肌酐和尿素氮含量的測(cè)定 各組小鼠末次給藥后，每只小鼠置于獨(dú)立代謝籠中，禁食6 h后剪尾取血，采用血糖儀檢測(cè)FBG；收集24 h尿液，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定24 h尿微量白蛋白(microalbuminuria，mAlb)含量；麻醉小鼠，下腔靜脈取血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)含量。

1.4.3腎臟Masson染色和免疫組織化學(xué)染色 取小鼠腎臟進(jìn)行剝離，部分腎皮質(zhì)固定，脫水，石蠟包埋，脫蠟，Masson染色進(jìn)行病理學(xué)觀察；按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行腎皮質(zhì)α-SMA(1 ∶200)染色，經(jīng)抗原修復(fù)、封閉、抗體孵育、DAB顯色，光鏡下觀察腎皮質(zhì)中α-SMA的分布并進(jìn)行量化。

1.4.4放射免疫法檢測(cè)腎皮質(zhì)cAMP的含量 另切取部分腎皮質(zhì)，勻漿后，按cAMP放射免疫分析藥盒說明書，檢測(cè)腎皮質(zhì)cAMP的含量。

1.4.5Western blot法檢測(cè)腎皮質(zhì)中LN、FN、PKA、CREB、p-CREB的蛋白表達(dá) 取各組小鼠部分腎皮質(zhì)，按照相應(yīng)的比例(20 mg組織 ∶200 μL裂解液)加入預(yù)冷的裂解液裂解腎皮質(zhì)，充分裂解后，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗滌后加入LN抗體(1 ∶1 000)、FN抗體(1 ∶2 000)、PKA抗體(1 ∶1 000)、CREB抗體(1 ∶1 000)、p-CREB抗體(1 ∶5 000)，4℃搖床過夜，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1 ∶500)，室溫?fù)u床孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光ECL顯影，以目的蛋白與β-actin的比值作為其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1WGP對(duì)DN小鼠生化指標(biāo)的影響由Tab 1可知，模型組小鼠的FBG明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，給予WGP低、中、高劑量12周后，與模型組相比，3個(gè)劑量WGP的FBG均明顯降低(P<0.01)；mAlb、Scr和BUN是反映腎功能的重要指標(biāo)，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠在飼養(yǎng)12周后，mAlb、Scr和BUN含量均有所升高(P<0.05)，與模型組相比，3個(gè)劑量WGP均可以降低DN小鼠mAlb、Scr和BUN含量(P<0.05)，進(jìn)而改善腎功能。

Tab 1 Effects of WGP on biochemical characteristics in DN

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig 1 Masson staining and statistical analysis of kidney tissues in DN mice(×200)

A：Control group; B：Model group; C：25 mg·kg-1WGP group; D：50 mg·kg-1WGP group; E：100 mg·kg-1WGP group; F:Effect of WGP on renal fibrosis in mice with DN.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

2.2小鼠腎臟組織的病理學(xué)變化為了觀察WGP對(duì)DN小鼠腎纖維化的作用，對(duì)腎臟切片進(jìn)行Masson染色，評(píng)估小鼠的腎纖維化程度。如Fig 1所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠腎小球肥大、硬化，腎小管上皮細(xì)胞萎縮，腎小球和腎小管間質(zhì)藍(lán)色區(qū)域面積明顯增多(P<0.01)，表明DN小鼠腎組織中膠原纖維沉積明顯增多，給予WGP處理后可以減少腎組織中膠原纖維的沉積(P<0.05)。

2.3WGP對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)α-SMA蛋白表達(dá)的影響腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞在腎纖維化中起著重要作用，其中α-SMA是這種表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白。為了觀察WGP對(duì)DN小鼠腎纖維化的作用，我們對(duì)腎臟切片進(jìn)行α-SMA免疫組化染色，評(píng)估小鼠的腎纖維化程度。如Fig 2所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中α-SMA表達(dá)增多(P<0.01)，WGP給藥組小鼠腎皮質(zhì)α-SMA表達(dá)逐漸減少(P<0.05或P<0.01)。

2.4WGP對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)cAMP含量的影響cAMP信號(hào)通路與腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展及腎小管上皮細(xì)胞增殖活化密切相關(guān)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證WGP對(duì)腎纖維化的作用，我們檢測(cè)了腎皮質(zhì)中cAMP含量。如Fig 3所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中cAMP含量升高(P<0.05)，3個(gè)劑量WGP可有效逆轉(zhuǎn)此變化(P<0.05)。以上結(jié)果表明，WGP可以改善DN狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞的增殖活化，從而延緩腎纖維化的進(jìn)程。

2.5WGP對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)LN和FN蛋白表達(dá)的影響LN和FN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，我們采用Western blot法來評(píng)估DN小鼠腎皮質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的水平。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中LN和FN表達(dá)增多(P<0.05)，給予WGP低、中、高劑量12周后，與模型組比較，3個(gè)劑量WGP的小鼠腎皮質(zhì)LN表達(dá)減少(P<0.05)，中、高劑量WGP可以降低DN小鼠腎皮質(zhì)FN表達(dá)(P<0.05)，見Fig 4。以上結(jié)果表明，WGP可以改善DN所致的小鼠腎纖維化。

Fig 2 α-SMA protein distribution and statistical analysis of renal cortex in DN mice(×200)

A：Control group; B：Model group; C：25 mg·kg-1WGP group; D：50 mg·kg-1WGP group; E：100 mg·kg-1WGP group; F: Effect of WGP on α-SMA expression in renal cortex.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Fig 3 Effects of WGP on cAMP content in renal

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.6WGP對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)PKA、CREB、p-CREB蛋白表達(dá)的影響為了探討WGP改善腎纖維化的分子機(jī)制，我們觀察了腎纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白PKA、CREB和p-CREB的變化，以及WGP對(duì)PKA、CREB和p-CREB水平的影響。如Fig 5所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中PKA和p-CREB的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，而對(duì)CREB無明顯影響，表明DN狀態(tài)下小鼠腎皮質(zhì)中PKA/CREB信號(hào)通路被激活。給予WGP干預(yù)后，3個(gè)劑量均可以降低DN小鼠腎皮質(zhì)中PKA和p-CREB蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，而對(duì)CREB無明顯影響。以上結(jié)果表明，WGP可以抑制DN狀態(tài)下小鼠腎皮質(zhì)中PKA/CREB的激活。

Fig 4 Effects of WGP on LN and FN expressions in renal cortex of DN

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

Fig 5 Effects of WGP on PKA，CREB and p-CREB expressions in renal cortex of DN

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 討論

人參屬于五加科多年生草本植物，其有效成分包含多糖、皂苷及揮發(fā)性成分等，其中WGP為主要化學(xué)成分。我國(guó)學(xué)者已經(jīng)從人參中分離出5種多糖成分，包括水溶性WGP、堿性WGP、人參淀粉、人參果膠及少量糖蛋白，具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、提高機(jī)體免疫系統(tǒng)功能等廣泛的藥理作用[8]，由于其所具有的抗氧化、降血糖等藥理作用與糖尿病發(fā)病進(jìn)程相關(guān)，我們推測(cè)其與DN發(fā)病環(huán)節(jié)也可能存在一定的關(guān)系，因此，我們對(duì)其進(jìn)行了初步的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，DN模型小鼠經(jīng)每天灌胃低、中、高劑量WGP連續(xù)12周后，3組均可有效降低DN小鼠FBG、mAlb、Scr及BUN水平，提示其對(duì)DN小鼠腎功能具有一定的保護(hù)作用。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，膠原蛋白過度沉積在腎纖維化形成中起著非常重要的作用。為了觀察DN小鼠腎纖維化的嚴(yán)重程度，我們采用Masson染色的方法檢測(cè)了DN小鼠腎皮質(zhì)中膠原的生成情況。DN小鼠飼養(yǎng)12周后，腎小球及腎小管間質(zhì)區(qū)域藍(lán)色膠原纖維的沉積增多。WGP的治療不僅降低DN小鼠FBG、改善腎功能，而且還可以減少腎小球硬化、腎小球及腎小管間質(zhì)膠原纖維的沉積，減緩腎纖維化的進(jìn)程。

腎纖維化的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，研究證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化在其中起著重要作用，其中α-SMA是這種表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白[12]。我們推測(cè)，在DN小鼠中，WGP可能通過抑制這種表型轉(zhuǎn)化過程而改善腎功能，并最終延緩腎纖維化的發(fā)生與進(jìn)展。因此，我們采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)中的α-SMA蛋白分布和表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，DN小鼠腎皮質(zhì)中α-SMA蛋白表達(dá)增多，給予WGP治療后，可以逐漸逆轉(zhuǎn)DN小鼠腎皮質(zhì)中α-SMA蛋白的表達(dá)。因此我們認(rèn)為，3個(gè)劑量WGP均可以有效地保護(hù)或延緩DN狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程。

間質(zhì)蛋白種類繁多，主要包括結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原和彈性蛋白，此外，還存在一些黏著蛋白如LN和FN，它們共同促使細(xì)胞同基質(zhì)結(jié)合，參與DN腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展[13]。為了觀察DN小鼠腎纖維化的嚴(yán)重程度，我們采用Western blot方法檢測(cè)了DN小鼠腎皮質(zhì)中2種黏著蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，DN小鼠腎皮質(zhì)中LN和FN表達(dá)增多，WGP治療后可降低黏著蛋白的表達(dá)，減輕腎纖維化程度。

最近Deb等[14]研究證實(shí)，cAMP/PKA信號(hào)通路的激活是誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制之一，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展。國(guó)內(nèi)學(xué)者翁琳等[15]研究同樣發(fā)現(xiàn)，小鼠MDCK細(xì)胞孵育cAMP抑制劑Forskolin后可引起間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白高表達(dá)，且該作用可被PKA抑制劑H89所抑制，說明在MDCK細(xì)胞中，cAMP-PKA信號(hào)通路可以直接促進(jìn)間質(zhì)纖維化進(jìn)程，在常染色體顯性遺傳性多囊腎病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。CREB是PKA通路下游的含堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bZIPs)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可控制細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，廣泛參與DN發(fā)生、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中，DN小鼠腎皮質(zhì)中cAMP含量升高，PKA和p-CREB的蛋白表達(dá)增加，表明cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路參與了DN狀態(tài)下腎纖維化的發(fā)生。給予WGP干預(yù)后，cAMP含量下降，PKA和p-CREB的蛋白表達(dá)均下降，表明WGP可能是通過抑制cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路改善DN小鼠腎纖維化。

綜上所述，WGP能夠降低血糖，改善DN小鼠腎功能，減少腎組織中膠原蛋白和黏著蛋白過度沉積。WGP可能是通過抑制cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路激活，進(jìn)而阻斷腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程，最終減輕腎纖維化程度。如能充分應(yīng)用WGP的藥理作用，將為臨床開發(fā)防治DN系列創(chuàng)新藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

(致謝：本文所有實(shí)驗(yàn)均在泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微血管生理調(diào)控實(shí)驗(yàn)中心完成，特別感謝對(duì)課題給予指導(dǎo)及幫助的老師。)

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