NF-κB和MAPK信號通路參與金雀異黃酮誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的體外研究

韋立群，徐成飛，李婉婷，潘曉杭，黃道航，甘嘉亮，唐雙意

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.藥學(xué)部、2.結(jié)直腸肛門外科，廣西 南寧 530021)

乳腺癌是導(dǎo)致婦女死亡的主要癌癥之一，其中三陰性乳腺癌具有侵襲力強、轉(zhuǎn)移性大、預(yù)后不良等生物學(xué)特點，三陰性乳腺癌約占所有乳腺癌的15%～20%[1]。全身化療是治療三陰乳腺癌的主要方法，但其副作用大，預(yù)后并不是很理想。臨床上，中藥治療惡性腫瘤已經(jīng)有了明顯的療效[2]。金雀異黃酮(genistein)化學(xué)名稱為 5,7,4′-三羥基異黃酮，是許多中藥重要的天然活性成分之一，廣泛分布于大豆、三葉草、葛根、染料木(金雀花)、廣豆根等豆科植物中，研究表明，金雀異黃酮具有抗癌及其他廣泛的藥理活性[3]。Phillip等[4]報道，金雀異黃酮能協(xié)同組蛋白去乙?；敢种苿?，誘導(dǎo)前列腺癌細胞死亡。我們前期研究表明，EGFR/PI3K/Akt通路參與金雀異黃酮誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的信號傳導(dǎo)[5]，但細胞凋亡信號傳遞相當(dāng)復(fù)雜，其中有許多不同通路參與，并互有交叉與對話。本次研究擬進一步探討NF-κB和MAPK通路是否參與乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的信號傳導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Corning公司；金雀異黃酮、磷酸酶抑制劑(Cocktail)、噻唑藍(MTT)、結(jié)晶紫購自美國 Sigma 公司；胎牛血清購自澳大利亞 Excellbio公司；GAPDH、Bax、Bcl-2抗體購自美國ABclonal公司；NF-κB、caspase-3、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK兔抗人單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司；熒光二抗購于EarthOx Life Science公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(加強型)、蛋白酶抑制劑PMSF購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及藥品儲存液配制人乳腺癌MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d傳代。金雀異黃酮用DMSO配制成100 mmol·L-1的儲存液，避光儲存于-20℃冰箱中，實驗時用DMEM培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度(DMSO終體積分數(shù)不超過0.1%)。

1.3MTT實驗將MDA-MB-231細胞以4 000個/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞貼壁，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含有金雀異黃酮(0、12.5、25、50、100、150 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別孵育24、36、48 h，加入20 μL 5 g·L-1的MTT，置于細胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h后，吸出孔內(nèi)的液體，加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶，在震蕩器上避光震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，在492 nm用酶標儀測定各孔的吸光度(A值)。細胞生長抑制率=(1-A給藥組/A正常對照組)×100%。

1.4細胞克隆實驗將MDA-MB-231細胞以500個/孔接種到6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入2 mL含有金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育36 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換新鮮的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 d(每3 d換1次液)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，再用PBS洗3遍，加入結(jié)晶紫室溫染色20 min，再用PBS洗3遍，拍照計算集落形成抑制率。集落形成抑制率=[1-(集落數(shù)/種殖細胞數(shù))]×100%。

1.5Westernblot實驗將MDA-MB-231細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%匯合時，加入含有金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中孵育36 h，收集培養(yǎng)瓶內(nèi)所有細胞，用PBS洗3遍，加入細胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶Cocktail=100 ∶1 ∶1)200 μL重懸細胞，靜置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心30 min，提取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加入適量的上樣蛋白緩沖液充分混勻，100℃高溫7 min使蛋白質(zhì)變性，取50 μg蛋白質(zhì)，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，使蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5% BSA室溫封閉60 min，一抗冰上孵育12 h，二抗室溫孵育60 min，最后用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜采集圖像，并分析灰度值。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1金雀異黃酮對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響如Fig 1所示，隨著藥物濃度和作用時間的增加，金雀異黃酮對細胞生長的抑制率逐漸增加。金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞24、36、48 h 的 IC50值分別為(78.73± 0.98)、(61.74 ± 1.07)、(58.37±1.48)μmol·L-1。

2.2金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞集落形成能力的影響如Fig 2所示，不同濃度的金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)干預(yù)MDA-MB-231細胞36 h后，再培育12 d，與對照組相比，隨著金雀異黃酮濃度升高，細胞的集落數(shù)明顯降低，并呈現(xiàn)量效趨勢(P<0.01)。提示金雀異黃酮可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的集落形成能力。

Fig 1 The inhibitory effect of different concentrations of genistein on MDA-MB-231 cells proliferation n=3)

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

Fig 2 Effect of genistein on colon formation of MDA-MB-231 cells and histogram of colony inhibitory rate n=3)

A: Control group; B: 25 μmol·L-1genistein; C: 50 μmol·L-1genistein; D: 100 μmol·L-1genistein.**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1).

2.3金雀異黃酮對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響如Fig 3所示，與對照組相比，金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞36 h后，Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Bax、caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)。提示金雀異黃酮對凋亡相關(guān)蛋白Bax及caspase-3具有明顯的誘導(dǎo)作用。

Fig 3 Effect of genistein on expression of apoptosis related proteins in MDA-MB-231 cells by Western blot n=3)

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

2.4金雀異黃酮對NF-κB及MAPK通路蛋白的影響如Fig 4所示，與對照組相比，金雀異黃酮呈濃度依賴性下調(diào)NF-κB (p65)和p-ERK蛋白的表達(P<0.01)，而上調(diào)p-JNK蛋白的表達。提示金雀異黃酮誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡可能與抑制NF-κB、ERK，激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。

3 討論

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程，目前研究發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡途徑主要有3條，分別為線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路[6]。抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細胞凋亡是其發(fā)揮藥理作用的重要機制之一。本研究中，MTT和集落形成實驗顯示，金雀異黃酮能明顯抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖。我們進一步從蛋白水平探討，Western blot檢測顯示，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達水平明顯減少，而促凋亡的Bax蛋白表達水平明顯提高。這些結(jié)果提示金雀異黃酮能明顯抑制人三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，再次證實了我們既往的研究結(jié)果。

Fig 4 Effect of genistein on expression of NF-κB (p65), ERK, p-ERK, JNK and p-JNK proteins in MDA-MB-231 cells by Western blot n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

NF-κB是研究最多的轉(zhuǎn)錄因子之一，p65是其中一個重要的亞型轉(zhuǎn)錄因子。被活化的p65可以通過核轉(zhuǎn)位參與機體免疫、組織損傷修復(fù)、胚胎發(fā)育等生理和病理過程的基因調(diào)控[7]。有研究表明，NF-κB與多種凋亡相關(guān)基因的易感性與耐藥性密切相關(guān)，在細胞存活與凋亡過程中有著雙向的作用。胞外各種刺激，如TNF-α、IL-6、IL-1、LPS等化學(xué)性或紫外線等物理性應(yīng)激物，可通過細胞表面受體激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而激活NF-κB途徑，促進細胞生長、惡性轉(zhuǎn)化、耐藥、腫瘤的轉(zhuǎn)移等[8]。王曉南等[9]曾報道，雷公藤紅素能誘導(dǎo)U937細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)Notch1信號通路以及NF-κB蛋白表達有關(guān)。因此，抑制NF-κB 活性可以抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、抑制化療耐藥、抑制炎癥、減少腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)[10]。本研究中，金雀異黃酮可以明顯抑制NF-κB (p65)蛋白表達水平，提示金雀異黃酮可以明顯抑制NF-κB通路的信號傳導(dǎo)。

MAPK包括 JNK、p38和ERK。JNK靜息狀態(tài)位于細胞質(zhì)中，當(dāng)受到信號刺激活化后，JNK發(fā)生磷酸化成為p-JNK，部分p-JNK轉(zhuǎn)入核內(nèi)，通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子及基因表達，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，p-JNK也能活化p53和c-Myc2等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子[11]。某些胞質(zhì)內(nèi)的成分，如Bcl-2、Bcl-xL和Bim等也可以被JNK活化，表明JNK通路不僅可以調(diào)節(jié)核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，還可以直接作用于胞質(zhì)底物而快速發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12]。我們的研究顯示，金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞后，JNK、p-JNK明顯上調(diào)，提示金雀異黃酮可能通過激活JNK/MAPK通路，參與細胞凋亡信號傳遞。

ERK是Ras-Raf-MAPK通路中的一種下游蛋白激酶，ERK1和ERK2是ERK通路中最重要的兩個成員[13]。未激活的ERK1/2都位于胞質(zhì)內(nèi)，ERK1/2一旦被激活則被磷酸化形成p-ERK1/2移位至細胞核，然后通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子，如c-Myc、c-jun、NF-κB等的活性，最終影響細胞代謝和功能，并產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)[14]。ERK在細胞的增殖、分化和凋亡中起著重要作用，ERK一方面能誘導(dǎo)Bcl-2等抗凋亡基因的表達發(fā)揮抗凋亡作用，另一方面，p-ERK1/2升高又能激活凋亡相關(guān)基因caspase-3等而發(fā)揮促凋亡作用[15]。我們的研究也顯示，金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞后，p-ERK的表達明顯降低，提示金雀異黃酮可能通過抑制ERK通路，誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示NF-κB、JNK和ERK信號通路可能參與了金雀異黃酮誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)合既往研究，提示金雀異黃酮呈多通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

(致謝：本實驗于廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心完成，感謝實驗室老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助！)

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