鉀通道阻滯劑四乙基銨敏感性鉀電流在肺高壓大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞中的變化

張雙雙，穆云萍，賀志成，顏曉曉，林默君

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，心血管病離子通道信號調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108)

肺高壓(pulmonary hypertension，PH)是由許多因素引發(fā)的以肺血管重塑、肺血管收縮升高、原位血栓的形成為典型病理改變的一類臨床病理生理綜合征。肺血管阻力、肺血管壓力持續(xù)性升高，肺血流受限，最終會導(dǎo)致右心衰竭，甚至死亡[1]。肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的收縮和增殖參與了PH發(fā)展過程中持續(xù)的肺血管收縮和血管重塑[2]，而胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的增加是PASMCs收縮和增殖的主要誘因和重要刺激[3]。鉀通道是細(xì)胞內(nèi)鉀離子(K+)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的主要途徑，在調(diào)節(jié)膜電位、[Ca2+]i、血管平滑肌收縮等方面都發(fā)揮著重要作用[4]。電壓依賴性鉀通道(voltage-depending potassium channel，KV)作為最常見的鉀通道家族，廣泛表達(dá)于PASMCs細(xì)胞膜。研究發(fā)現(xiàn)，KV故障與PH的產(chǎn)生和發(fā)展有很大關(guān)聯(lián)，抑制KV會引起細(xì)胞內(nèi)K+積聚，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生去極化，進(jìn)而激活L型電壓門控Ca2+通道，胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，增加[Ca2+]i，使得肺血管持續(xù)性收縮，而持續(xù)的血管收縮最終會影響PASMCs的增殖和凋亡，引起肺血管重構(gòu)[5]。我們的前期研究表明，PH大鼠模型PASMCs中[Ca2+]i明顯提高，各類Ca2+通道功能明顯增強(qiáng)[6]，但是PASMCs中KV的功能還有待進(jìn)一步的研究。因此，本文使用慢性低氧(chronic hypoxia，CH)、野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的兩種PH大鼠模型，探討鉀通道阻滯劑四乙基銨(tetraethylammonium，TEA)敏感性KV電流的電生理特性及其在PH中的變化。

1 材料與方法

1.1試劑氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鈣(CaCl2)、HEPES、EGTA、二甲基亞砜(DMSO)，均購自Sigma公司。野百合堿(MCT，Sigma)配制方法：首先采用HCl(1 mol·L-1)溶解，其次用NaOH(1 mol·L-1)，使得溶液pH為7.0，最后用雙蒸水定容成2%溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。TEA(Sigma)用雙蒸水配成2.5 mmol·L-1的貯存液備用。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.1鉀通道電流電極內(nèi)液的配制 電極內(nèi)液(mmol·L-1)：KCl 35、Mg-ATP 5、葡萄糖酸鉀 90、NaCl 10、GTP 0.5、HEPES 10，用5 mol·L-1KOH調(diào)節(jié)pH至7.2。高濃度ATP用于阻斷ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channels，KATP)電流，電極內(nèi)液無Ca2+，最大限度阻斷鈣離子激活性鉀通道(Ca2+-activated K+channels，KCa)電流，以保證記錄到的鉀電流基本為KV電流。

1.1.2通道灌流液的配制 通道灌流液(mmol·L-1)：葡萄糖 5.2、NaCl 136、HEPES 10、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.2，用3 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.2肺高壓模型的建立

1.2.1CH肺高壓模型的建立 清潔級♂ SD大鼠(體質(zhì)量200～220 g)，購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(閩)2012-0001]，隨機(jī)分為正常對照組、CH組。將兩組動物同時放于密封的有機(jī)玻璃飼養(yǎng)箱內(nèi)，CH組飼養(yǎng)箱內(nèi)氧分壓調(diào)至9.5%～10.5%，對照組箱內(nèi)維持正常氧分壓，常規(guī)飼養(yǎng)3周，正常飲食飲水，飼養(yǎng)箱每天定時清理。

1.2.2MCT肺高壓模型的建立 清潔級♂ SD大鼠(體質(zhì)量150～160 g)，隨機(jī)分為對照組和MCT組。MCT 組采用50 mg·kg-1的劑量一次性腹腔注射MCT(2%)，對照組則采用相同的方法給予等體積生理鹽水，常規(guī)飼養(yǎng)3周，正常飲食飲水。

1.3右心室內(nèi)壓測定各組大鼠飼養(yǎng)3周后，用20%烏拉坦(0.5 g·kg-1)腹腔注射麻醉，并行腹腔肝素化(500 IU·kg-1)處理，迅速分離右頸外靜脈，經(jīng)靜脈行右心室(right ventricle, RV)插管術(shù)，PE50管(0.6mm ID×0.9mm OD)成功進(jìn)入RV后，對各組的右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure, RVSP)進(jìn)行記錄。

1.4右心室重量指數(shù)計算右心室內(nèi)壓測定結(jié)束后，對動物實(shí)施安樂死，隨后快速剖開胸腔，并取出心、肺組織，置于濾紙上，沿心臟房室交界剪去左右心房和周圍大血管組織，完整保留左右心室，隨后沿室間隔分離RV，反復(fù)用濾紙吸干其上的血液和水分，最后用分析天平稱重。將左心室與室間隔(left ventricular wall plus septum, LV+S)剖開，同樣用濾紙吸干其上的血液和水分，然后采用分析天平進(jìn)行稱重，最后計算右心室質(zhì)量指數(shù)(right ventricular mass index, RVMI)：RVMI= RV/(LV+S)。

1.5PASMCs培養(yǎng)及鑒定各組大鼠血流動力學(xué)測定結(jié)束后，開胸取出心肺，在HEPES緩沖鹽溶液(HBSS)中分離肺葉內(nèi)動脈，用棉簽去血管內(nèi)皮，然后將動脈放置于4℃的HBSS中，恢復(fù)20 min。將血管組織置于37℃含膠原蛋白酶I、木瓜蛋白酶、牛血清蛋白的酶溶液中消化20 min，取出，并用無Ca2+的HBSS終止消化。將細(xì)胞混懸液置于35 mm培養(yǎng)皿，并用含1% FBS、100 kU·L-1鏈霉素和0.1 g·L-1青霉素的F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)12～24 h。

對培養(yǎng)12～24 h的PASMCs進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定。首先將細(xì)胞滴在培養(yǎng)皿中的玻璃片中央進(jìn)行培養(yǎng)，后用PBS清洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min；再用PBS沖洗5 min×3次，用蒸餾水沖洗，0.3% H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS沖洗5 min×3次；滴加封閉血清，室溫孵育40 min，傾去多余液體；滴加鼠抗actin單克隆抗體(1 ∶400)，陰性對照采用PBS，4℃濕盒孵育過夜，然后在37℃復(fù)溫45 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；DAB顯色劑顯色，然后在顯微鏡下觀察，掌握顯色程度，蒸餾水充分沖洗終止染色；蘇木精復(fù)染2 min；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性結(jié)果判斷：胞質(zhì)內(nèi)呈棕褐色絲狀條紋沉淀。

1.6全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測定鉀電流取培養(yǎng)12～24 h的PASMCs于細(xì)胞記錄槽內(nèi)，用細(xì)胞外液灌流；玻璃微電極(電阻3～5 MΩ)內(nèi)充灌正?；蚝?.5 mmol·L-1TEA的電極內(nèi)液。選擇貼壁良好、形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞膜光滑完整且折光性好的大鼠PASMCs，記錄細(xì)胞膜的KV電流。鉗制電位為-80 mV，階躍電壓10 mV，給予從-80 mV至+60 mV的去極化脈沖刺激，并用pClamp軟件分析。

2 結(jié)果

2.1PH模型的鑒定如Fig 1所示，與對照組相比，CH組、MCT組的RVSP和RVMI均明顯升高(P<0.01)，其中CH和MCT模型構(gòu)建成功率高達(dá)80%，表明CH和MCT均能夠引起大鼠肺動脈壓力的明顯升高，導(dǎo)致右心室肥厚，PH模型構(gòu)建成功。

2.2PASMCs的免疫化學(xué)鑒定取原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(Fig 2)，F(xiàn)ig 2A為陰性對照，F(xiàn)ig 2B為陽性對照。在高倍鏡下可見細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，卵圓形居中，陽性對照胞質(zhì)內(nèi)呈棕褐色絲狀條紋沉淀，即可判斷為PASMCs。

2.3TEA對對照組KV電流的影響-80 mV鉗制電壓下，給予去極化脈沖刺激從-80 mV到+60 mV，階躍電壓10 mV，記錄KV特異性阻滯劑TEA(2.5 mmol·L-1)對PASMCs KV電流的影響。Fig 3結(jié)果顯示，PASMCs在階躍電壓刺激下，隨刺激電壓強(qiáng)度的增加，KV電流也隨之變大，并且形成I-V曲線[pA/pF：(40.06±3.08)，F(xiàn)ig 3A]。TEA干預(yù)后，PASMCs的I-V曲線明顯減小[pA/pF：(17.68±2.01)，P<0.01，F(xiàn)ig 3B]。表明TEA能夠明顯抑制PASMCs KV電流的I-V曲線，但是對KV電流的形態(tài)無明顯影響。

Fig 1 CH and MCT up-regulated RVSP and RVMI

Typical traces showing RVSP in control (A), CH (B) and MCT (C).Average values of RVSP (D) in control (n=26), CH-induced rats (n=27) and MCT-treated rats (n=22) and average values of RVMI (E) of control (n=21), CH-induced rats (n=20) and MCT-treated rats (n=25).**P<0.01vscontrol.

Fig 2 Immunohistochemical staining identified PASMCs (×400)

Immunocytochemical staining by α-actin (smooth muscle specific) antibody in PASMCs.A: negative; B: positive.

2.4KV電流在對照組中的變化及TEA的干預(yù)作用為進(jìn)一步觀察KV電流在CH致PH大鼠PASMCs中的變化，在相同鉗制電壓和階躍電壓下，去極化脈沖刺激后記錄KV電流。結(jié)果顯示，與正常組相比，CH組PASMCs KV電流I-V曲線明顯減小[pA/pF：(36.19 ± 3.18)，P<0.05，F(xiàn)ig 4A]，表明CH處理能夠降低大鼠PASMCs KV電流。隨后，觀察KV抑制劑TEA對CH大鼠PASMCs鉀電流的干預(yù)作用，結(jié)果顯示，與加藥前相比，TEA明顯抑制CH組KV的I-V曲線[pA/pF：(15.50±3.64)，P<0.01，F(xiàn)ig 4B]。表明TEA同樣能夠明顯抑制CH大鼠PASMCs中KV電流的I-V曲線，而KV電流I-V曲線的形態(tài)在加藥前后無明顯變化。

2.5KV電流在MCT大鼠中的變化及TEA的干預(yù)作用我們繼續(xù)觀察了MCT預(yù)處理對PASMCs中KV電流的影響，相同鉗制電壓和階躍電壓下，給予相同的去極化脈沖刺激，記錄MCT致PH大鼠KV電流。結(jié)果顯示，與正常組相比，MCT組KV電流I-V曲線明顯降低[pA/pF：(26.26 ± 4.14)，P<0.01，F(xiàn)ig 5A]，且比CH組降低的更明顯，表明MCT預(yù)處理能夠明顯降低大鼠PASMCs KV電流。繼續(xù)觀察TEA對MCT組KV電流的干預(yù)作用，結(jié)果顯示，TEA作用后，MCT大鼠KV的I-V曲線明顯降低[pA/pF：(18.76±4.47)，P<0.01，F(xiàn)ig 5B]。表明KV抑制劑TEA明顯抑制MCT大鼠PASMCs中KV電流的I-V曲線，而對I-V曲線的形態(tài)無明顯影響。

2.6TEA的抑制作用在PH大鼠中的變化最后，觀察CH和MCT誘導(dǎo)的PH大鼠中TEA對KV電流抑制作用的變化。利用pClamp分析軟件將加TEA之前的KV電流曲線減去同一細(xì)胞加藥后的電流曲線，即為TEA敏感性鉀電流曲線，也代表了TEA對細(xì)胞KV電流的抑制作用。因此，我們通過分析不同組別PASMCs中TEA敏感性鉀電流的大小，反映TEA對KV電流抑制作用的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示，與正常組(30.09 ± 2.81)比較，CH組PASMCs的TEA敏感性鉀電流減小至(4.57 ± 0.54)(P<0.01)，MCT組的TEA敏感性鉀電流減小至(2.36 ± 0.76)(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 6)。以上結(jié)果表明，TEA敏感性鉀電流在CH和MCT誘導(dǎo)的PH大鼠明顯減小，即TEA對PASMCs中KV電流的抑制作用明顯降低。

Fig 3 TEA decreased whole-cell KV currents in PASMCs of control rats

A: Original IKVtrace in PASMCs of rats in control group; B: Original IKVtrace in PASMCs of control rats in the presence of TEA; C: Curve graphs of the relationship between current density and voltage in normal group (n=10).**P<0.01vscontrol group.

Fig4TEAdecreasedKVcurrentsinPASMCsofCH-treatedrats

A: Original IKVtrace in PASMCs of CH-treated rats; B: Original IKVtrace in PASMCs of CH rats in the presence of TEA; C: Curve graphs of the relationship between current density and voltage in CH-treated rats (n=6).**P<0.01vsCH group.

3 討論

研究表明，CH刺激可以使肺動脈收縮，血管張力升高，PASMCs多種Ca2+通道蛋白表達(dá)和功能增強(qiáng)[7-10]，引起胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，同時CH能夠抑制PASMCs凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]，引起PH。MCT可直接損傷肺血管內(nèi)皮，使內(nèi)皮膠原纖維裸露，導(dǎo)致肺血管血栓，并引發(fā)PASMCs增生等多種病理改變，引起肺血管壁重塑，最終形成PH[12]。研究表明，KV參與調(diào)節(jié)PASMCs的靜息膜電位，決定肺血管張力[10]。抑制鉀通道，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化，引起KV開放，最終使得[Ca2+]i提升，血管收縮性加強(qiáng)[11]。因此，鉀通道一直是治療PH的重要靶點(diǎn)。

Fig 5 TEA decreased KV currents in PASMCs of MCT-induced rats

A: Original IKVtrace in PASMCs of MCT-induced rats; B: Original IKVtrace in PASMCs of MCT rats in the presence of TEA; C: Curve graphs of the relationship between current density and voltage in MCT-induced rats (n=5).**P<0.01vsMCT group.

Fig 6 Alteration of TEA-sensitive KV currents in PASMCs of PH rats

Average whole cell current-voltage (I-V) plots of outward TEA-sensitive KVcurrents recorded in PASMCs of control (n=10), CH (n=6) and MCT (n=5)-induced rats with whole cell patch-clamp techniques.Currents have been corrected for cell capacitance and plotted as current density.All currents were evoked at a holding potential of -80mV.**P<0.01vscontrol group.

本研究使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，首先在正常大鼠PASMCs上觀察了KV特異性阻滯劑TEA對KV電流的影響。結(jié)果顯示TEA干預(yù)后，PASMCs上記錄到的KV電流明顯減小，表明TEA特異性阻斷了PASMCs細(xì)胞膜上的KV，使自由通過通道的K+明顯減少，導(dǎo)致形成的鉀電流減小，該研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本一致。有研究表明，CH刺激下PASMCs細(xì)胞膜上的KV通道的活性與PH的發(fā)生、發(fā)展及肺血管的重塑密切相關(guān)[10]，CH處理可明顯抑制PASMCs的KV通道活性，從而使Ca2+通道開放，最終導(dǎo)致PH的形成。本研究的結(jié)果與此基本一致，CH組的KV電流明顯減小，且TEA干預(yù)后同樣明顯抑制CH大鼠中記錄到的KV電流。

MCT作為一種較為成功的PH模型，它的代謝產(chǎn)物野百合吡啶能破壞肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)PASMCs增殖，而PASMCs增殖過度又會引發(fā)肺血管重塑。本研究中，從電流密度-電壓關(guān)系曲線圖中，我們觀察到MCT誘導(dǎo)的PH大鼠PASMCs的KV電流明顯減小，且與CH組相比，MCT誘導(dǎo)的PH大鼠KV電流被抑制的更明顯。同樣，TEA干預(yù)后，明顯抑制MCT大鼠PASMCs上記錄到的KV電流。CH和MCT誘導(dǎo)PH大鼠中KV電流密度明顯減小，同時，TEA敏感性鉀電流也明顯減小，TEA對PASMCs中KV電流的抑制作用明顯降低。提示PH大鼠模型PASMCs上的KV通道的數(shù)量或者活性減小，同時具體是哪種類型的KV作用減小還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CH和MCT誘導(dǎo)的PH能夠明顯抑制大鼠PASMCs上KV的開放，使得通過的KV電流明顯減??；KV特異性抑制劑TEA可以阻斷正常大鼠和PH大鼠PASMCs上的KV，明顯降低鉀電流。因此，明確PH大鼠PASMCs鉀電流的變化有助于揭示PH的發(fā)病機(jī)制，對于針對PH的新藥研究具有非常重要的意義。

(致謝：非常感謝美國Johns Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院肺及重癥醫(yī)學(xué)系James S.K.Sham教授在實(shí)驗(yàn)設(shè)計和膜片鉗技術(shù)操作中給予的無私幫助。)

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