CXCL12/CXCR4在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟中的表達及芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯的作用

高 梅，章 敏，司 敏，陳鏡宇，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)是課題組對白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)的主要有效成分芍藥苷(paeoniflorin,Pae)結(jié)構(gòu)進行酯化修飾，合成的新型活性單體。研究表明，TGP和Pae均具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用，可明顯抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，改善關(guān)節(jié)、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)病理變化。然而，Pae生物利用度低，導(dǎo)致其起效慢。課題組前期研究表明，CP-25(25、50、100 mg·kg-1)對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AA)大鼠有確切的治療作用，不僅可以明顯減輕AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，改善滑膜細胞異常增殖[1]；還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)樹突狀細胞的功能[2]，改善AA大鼠脾臟的病理[3]，包括減輕白髓增生和紅髓充血，減少動脈周圍淋巴鞘細胞密度，減輕淋巴小結(jié)、邊緣區(qū)和生發(fā)中心增生，但具體機制不清楚。外周淋巴組織淋巴細胞選擇性的游走及歸巢主要由趨化因子介導(dǎo)。趨化因子CXCL12及其受體CXCR4通過介導(dǎo)T、B細胞的遷移、增殖和活化，參與類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的免疫反應(yīng)[4]。RA病人的關(guān)節(jié)滑膜、滑液和血液中CXCL12的水平明顯高于正常人[5]，但RA時脾臟中CXCL12/CXCR4的表達情況，以及脾臟的病理改變是否與CXCL12/CXCR4有關(guān)，仍不清楚。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，成功建立AA模型，采用CP-25的有效濃度(50 mg·kg-1)給藥，觀察脾臟組織的病理結(jié)構(gòu)改變、脾臟中CXCL12和CXCR4的表達，探討AA脾臟病理改變與CXCL12/CXCR4的關(guān)系，以及CP-25免疫調(diào)節(jié)作用的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量(180±20)g，清潔級，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。

1.1.2藥物與試劑 CP-25由本所藥化室提供，白色結(jié)晶狀粉末，純度大于98%；卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)購自北京生物制品所；CXCL12 ELISA試劑盒購于武漢華美公司；CXCL12、CXCR4抗體購于Abcam公司；ECL發(fā)光顯色試劑盒購于Thermo Scientific 公司。

1.1.3儀器 Olympus顯微成像系統(tǒng)；ImageQuant LAS 4000 熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國 GE 公司)；BioTek Elx×808 酶標儀(美國BioTek公司)；RM2135石蠟切片機(德國萊卡)。

1.2方法

1.2.1AA模型的建立 將80℃水浴滅活1 h的BCG與高壓滅菌的石蠟充分研磨混勻，制成 10 g·L-1的CFA，于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL致炎，造模當天設(shè)為d 0。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、CP-25(50 mg·kg-1)組、MTX(0.5 mg·kg-1)組，同時設(shè)置正常對照組。造模后d 14開始給藥，d 28處死大鼠。CP-25按照50 mg·kg-1體質(zhì)量灌胃給藥，每天1次；MTX按照0.5 mg·kg-1體質(zhì)量灌胃給藥，每3 d一次。

1.2.2脾臟病理學(xué)觀察 造模后d 28，分別將正常對照組、模型組、CP-25組和MTX組大鼠放血處死，迅速剪開大鼠腹部，分離、留取脾組織，剪取部分脾組織置于4%甲醛溶液中固定，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，制作病理切片(厚約5 μm)，經(jīng)HE染色后，觀察脾臟組織病理改變，進行病理評分。脾臟病理從動脈周圍淋巴鞘(periarteriolar lymphoid sheath，PALS)的細胞密度、淋巴小結(jié)(lymphoid nodule，LN)增生進行判定，按照病變從輕到重，進行0～3級病理評分。PALS細胞密度評分：0=正常；1=細胞密度輕微增大；2=細胞密度中度增大，有細胞擁擠；3=細胞密度重度增大，有細胞疊加。LN增生評分：0=正常；1=輕微增生，可見生發(fā)中心；2=中度增生，生發(fā)中心明顯；3=過度增生，生發(fā)中心多見。

1.2.3免疫組化法檢測脾臟組織中CXCL12和CXCR4水平 脾臟組織制作病理切片后，經(jīng)脫蠟水化，細胞通透，抗原修復(fù)，稀釋相應(yīng)比例的CXCL12和CXCR4的一抗，4℃過夜，二抗孵育，顯色劑顯色后封片。采集400倍視野圖像，利用Image-Pro Plus分別對各切片中免疫組化染色陽性表達進行半定量分析，測定脾臟組織中CXCL12和CXCR4蛋白染色平均光密度(mean optical density，MOD)值后，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4Western blot檢測脾臟組織中CXCR4水平 剪取部分脾組織，常規(guī)裂解(RIPA ∶PMSF=99 ∶1)充分研磨后，Lowry 法蛋白定量，加蛋白上樣緩沖液，沸水煮8 min，取15 μL蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉/TPBS封閉2 h，放入稀釋相應(yīng)比例的CXCR4一抗，4℃過夜，加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。ECL試劑盒顯影。結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)掃描后，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達水平。

1.2.5ELISA檢測脾臟組織中CXCL12水平 剪取各組大鼠脾組織0.15 g，分別加PBS 100 μL，充分研磨后，離心取上清，用ELISA試劑盒測CXCL12的表達。

2 結(jié)果

2.1CP-25對AA大鼠脾臟病理的影響Fig 1 HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰，紅髓與白髓界限較明顯；與正常對照組相比，AA組大鼠紅髓與白髓界限模糊，紅髓充血，白髓增生，PALS的細胞密度增加，LN增多，CP-25可以減少PALS的細胞密度，改善LN增生。

Fig 1 Effect of CP-25 on histopathology of spleen in AA rats(×100)

2.2CP-25對AA大鼠脾臟CXCL12表達的影響ELISA結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AA組大鼠脾臟中CXCL12的表達明顯升高(P<0.05)；與AA組相比，CP-25組和MTX組中CXCL12表達下降(P<0.05)(Fig 2A)。免疫組化結(jié)果顯示，各組脾臟淋巴細胞胞質(zhì)均呈免疫陽性反應(yīng)；與正常對照組比較，AA組大鼠脾臟中CXCL12表達增強(P<0.05)；與AA組比較，CP-25組和MTX組中CXCL12表達減弱(P<0.05)(Fig 2B～2F)。

2.3CP-25對AA大鼠脾臟CXCR4表達的影響Western blot結(jié)果顯示，AA大鼠脾臟中CXCR4表達較正常對照組增加(P<0.01)，CP-25和MTX可以降低脾臟中CXCR4的表達(P<0.05)(Fig 3A)。免疫組化結(jié)果顯示，各組脾臟淋巴細胞胞質(zhì)均呈免疫陽性反應(yīng)；與正常對照組比較，AA組大鼠脾臟中CXCR4表達增強(P<0.05)；與AA組比較，CP-25組和MTX組中CXCR4表達減弱(P<0.05)(Fig 3B～3F)。

Fig 2 Effect of CP-25 on expression of CXCL12 in spleen of AA

A: ELISA results of CXCL12; B: Normal; C: AA; D: CP-25 50 mg·kg-1; E: MTX 0.5 mg·kg-1; F:MOD of CXCL12.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsAA.

2.4脾臟病理評分與CXCL12/CXCR4的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，脾臟組織的PALS和LN增生的病理評分與脾臟組織中CXCL12和CXCR4的表達之間均存在正相關(guān)(Fig 4)。CP-25改善脾臟病理改變可能與下調(diào)脾臟中CXCL12/CXCR4的表達有關(guān)。

Fig 3 Effect of CP-25 on expression of CXCR4 in spleen of AA rats

3 討論

AA模型是一種T細胞依賴的免疫性炎癥動物模型，在臨床表現(xiàn)和病理機制等方面與RA有許多相似特征，是研究RA病理機制的較理想動物模型[6]。脾臟是人體最大的免疫器官，正常脾臟由白髓和紅髓組成，白髓是淋巴細胞的聚集區(qū)，由PALS和LN組成。紅白髓交界處的邊緣區(qū)富含T、B淋巴細胞，是抗原提呈、啟動免疫應(yīng)答的場所。PALS主要由大量的T細胞構(gòu)成，RA時大量T細胞異?；罨鲋撤只癁樾?yīng)T細胞，這些T細胞浸潤在滑膜組織和關(guān)節(jié)液，產(chǎn)生大量的促炎細胞因子，導(dǎo)致滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞[7]。淋巴小結(jié)主要由大量B細胞構(gòu)成，是B細胞活化和分化為漿細胞、記憶B細胞的場所。活化的B細胞通過抗原提呈參與T細胞的活化，通過產(chǎn)生自身抗體和記憶B 細胞維持RA自身免疫反應(yīng)的持續(xù)存在[8]。病理結(jié)果顯示，AA模型大鼠脾臟白髓與紅髓界限模糊，白髓增生，動脈周圍淋巴鞘細胞密度增加，淋巴小結(jié)增生，提示AA時脾臟中T、B細胞聚集，發(fā)生免疫應(yīng)答。

CXCL12屬于趨化因子家族，又稱為基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，具有多種生物功能，如干細胞動員、炎性細胞浸潤和血管生成，參與各種疾病過程，如癌癥、艾滋病、自身免疫性疾病和缺血性疾病等[9]。CXCL12有兩種受體，即CXCR4和CXCR7，主要通過CXCR4發(fā)揮作用，CXCR4是7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體[10]。在RA的滑膜組織及關(guān)節(jié)液中CXCL12的水平增加，CXCL12可以促進血管形成[11]，介導(dǎo)表達CXCR4的T細胞和B細胞向滑膜組織遷移[4]。CXCL12促進軟骨細胞分泌MMP-1、MMP-13，使軟骨降解，使用CXCR4受體拮抗劑AMD3100可以降低滑膜液中MMP-1和MMP-13的水平[12]，改善膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的全身表現(xiàn)。這些研究表明，CXCL12/CXCR4有利于炎性效應(yīng)細胞向關(guān)節(jié)遷移并且滯留，促進新生血管形成，從而推動炎性過程發(fā)展，在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。但CXCL12/CXCR4是否與RA的脾臟病理改變有關(guān)仍不清楚。本實驗結(jié)果顯示，AA大鼠脾臟PALS細胞密度和LN增生，均與CXCL12以及CXCR4的表達水平存在正相關(guān)，提示CXCL12/CXCR4與AA脾臟的病理改變有關(guān)，可能通過趨化作用，促進淋巴細胞在脾臟的聚集，其具體的作用及機制有待進一步研究。

CP-25是課題組對TGP的主要有效成分Pae進行結(jié)構(gòu)修飾，合成的新型活性單體。研究表明，Pae能明顯抑制 CIA大鼠B淋巴細胞增殖，降低血清中IgA、IgG和IgM水平，降低血清中B細胞刺激因子和脾臟BAFF-R表達[13]。Pae抑制關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜細胞增殖，降低IL-1、TNF-α和PGE2等促炎性細胞因子分泌[14]。然而Pae生物利用度低，導(dǎo)致其起效慢。前期研究發(fā)現(xiàn)，CP-25 (25、50、100 mg·kg-1) 對AA大鼠具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，可以減輕AA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，改善關(guān)節(jié)、脾臟病理變化，減少巨噬細胞活化，減少血清中促炎細胞因子如IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的水平，上調(diào)抗炎細胞因子TGF-β1的水平[3]。CP-25通過調(diào)節(jié)PGE2-EP4-cAMP和TNF-α-TNFR1-TRADD-TRAF2-NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)樹突細胞功能[2]。CP-25可以抑制滑膜細胞的異常增殖，下調(diào)滑膜細胞分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[1]。本實驗發(fā)現(xiàn)，AA大鼠給予CP-25或者MTX后，CXCL12和CXCR4表達減少，脾臟PALS的細胞密度減少，LN增生得到改善，且脾臟的這些病理改變與CXCL12/CXCR4的表達呈正相關(guān)，提示CP-25可能通過減少AA大鼠脾臟組織中CXCL12和CXCR4的表達，減少淋巴細胞向脾臟的遷移，從而改善脾臟的病理改變，減輕免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。MTX作為RA的治療藥物，可以降低炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-3等水平，但由于免疫抑制作用，產(chǎn)生一些副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、皮疹、過敏性肺炎等[15]。在本實驗中，MTX作為陽性對照藥的作用與CP-25相似，但在實驗過程中出現(xiàn)老鼠體質(zhì)量下降、食欲不振、缺乏運動等現(xiàn)象，而CP-25給藥組未出現(xiàn)此現(xiàn)象，這也與前期課題組研究結(jié)果相符，表明CP-25的耐受性好。因此，作為一種有前景的治療RA的藥物，不良反應(yīng)少可能是CP-25的優(yōu)勢。

Fig 4 Correlation between pathological changes of spleen and expression of CXCL12/ CXCR4

綜上所述，CXCL12及其受體CXCR4的高表達與AA脾臟的病理改變有關(guān)，可能是通過趨化作用促進淋巴細胞在脾臟的聚集，從而促進AA脾臟中免疫反應(yīng)的發(fā)生；抑制AA大鼠脾臟中CXCL12和CXCR4的表達可能是CP-25發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制之一。

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