咽舒康口服液薄層鑒別及含量測定研究

汪宏雷，吳成志，李易陽

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 藥劑科，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 中藥房，安徽 蕪湖 241000；3.澳門科技大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，中國 澳門 519020)

抗生素是治療咽炎的主要臨床藥物，但療效并不明確，且在臨床使用中常存在耐藥性。皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院根據(jù)治療咽炎的經(jīng)驗方開發(fā)了咽舒康口服液，該處方由玄參、黃芩、青果、麥冬等七味中藥組成。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，我們對處方中的各味藥按君臣佐使的順序進(jìn)行薄層及含量測定，提出青果、玄參、黃芩的薄層鑒別方法及黃芩中黃芩苷的質(zhì)量控制方法，制定咽舒康口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 所用儀器包括U3000型高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、KQ-500VDV型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)、DZKW-D-4型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)、WFH-3型三用紫外儀(上海米青科實業(yè)有限公司)、1011A型數(shù)顯恒溫干燥箱(常州市萬豐儀器制造有限公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(批號：110715-201317，規(guī)格：40 mg) 、玄參對照藥材(批號：121008-201609，規(guī)格：1 g)和青果對照藥材(批號：121643-201302，規(guī)格：1 g)均購自中國食品藥品檢定研究院；咽舒康口服液(批號:20160912、20160914、20160916)；色譜甲醇；其余試劑均為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 黃芩的鑒別[1-3]取本品(批號:20160912、20160914、20160916)20 mL，依據(jù)文獻(xiàn)[1-3]步驟制備黃芩供試品溶液、1 g/L的黃芩苷對照品和缺黃芩的陰性口服液樣品。參照薄層色譜法[2](2015版《中華人民共和國藥典》四部通則)試驗，制備黃芩苷對照品-陰性樣品-樣品薄層板。結(jié)果：不同批號供試品溶液在硅膠G薄層板上顯色板點與黃芩苷對照品顯色Rf相同，且陰性溶液色譜無干擾。見圖1。

1.黃芩苷對照品；2.陰性樣品；3.樣品批號20160912；4.樣品批號20160914；5.樣品批號20160916 。

圖1 黃芩TLC圖

2.2 玄參的鑒別[1,4-6]取本品(批號:20160912、20160914、20160916)10 mL，依據(jù)文獻(xiàn)[1,4-6]步驟制備玄參樣品溶液、玄參對照溶液和缺玄參的陰性口服液樣品。參照薄層色譜法(2015版《中華人民共和國藥典》四部通則)試驗，制備玄參對照品-陰性樣品-樣品薄層板。結(jié)果：不同批號供試品溶液在硅膠G薄層板上顯色板點與玄參對照品顯色Rf相同，且陰性樣品色譜無干擾。見圖2。

1.陰性樣品；2.玄參對照藥材；3.樣品批號20160912；4.樣品批號20160914；5.樣品批號20160916。

圖2 玄參TLC圖

2.3 青果的薄層鑒別[1,7-8]取本品(批號:20160912、20160914、20160916)10 mL，依據(jù)文獻(xiàn)[1,7-8]步驟制備青果樣品溶液、青果對照溶液和缺青果的陰性口服液樣品。參照薄層色譜法(2015版《中華人民共和國藥典》四部通則)試驗，制備青果對照品-陰性樣品-樣品薄層板。結(jié)果：不同批號供試品溶液在硅膠G薄層板上顯色板點與對照藥材顯色Rf相同，且陰性樣品色譜無干擾。見圖3。

1.青果對照藥材；2.樣品批號20160912；3.樣品批號20160914；4.樣品批號20160916；5.陰性樣品。

圖3 青果TLC圖

3 含量測定

通過對咽舒康口服液進(jìn)行處方分析并結(jié)合藥典中各個藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，最終將處方中的黃芩作為考察成分，以其所含的黃芩苷作為質(zhì)量控制的指標(biāo)進(jìn)行含量的測定[1,9-10]。

3.1 色譜條件 選用依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm) 色譜柱；以0.1%磷酸水溶液∶甲醇=53∶47為流動相；流速為1.0 mL/min，柱溫30℃；檢測波長280 nm；按黃芩苷計其理論塔板數(shù)應(yīng)不少于2500。

3.2 溶液的制備

3.2.1 黃芩苷對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品，用甲醇配制成22.44 mg/L的溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備 精密移取本品1 mL加甲醇定容至25 mL容量瓶中，從中精密量取1 mL置20 mL容量瓶中用甲醇定容，取續(xù)濾液即得。

3.2.3 陰性樣品溶液的制備 取缺黃芩陰性制劑，同供試品溶液制備方法制備。

3.2.4 專屬性試驗 取黃芩苷對照品溶液、供試品溶液及咽舒康陰性溶液各5 μL，按“3.1”色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：在與對照品色譜相應(yīng)位置上供試品溶液有色譜峰，而陰性樣品未出現(xiàn)色譜峰，表明在該HPLC測定條件下，黃芩苷的測定無陰性干擾，見圖 4。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按“3.1”色譜條件，分別精密吸取 2、4、6、8、10 μL“3.2.1”項下已制備的黃芩苷對照品溶液，以黃芩苷的量(ng)為橫坐標(biāo)，測得色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得其方程:A=0.0576C+0.0816；R2=0.999 97。結(jié)果表明，黃芩苷在濃度為67.32～157.08 ng的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4 精密度試驗 連續(xù)將對照品為22.44 mg/L的溶液進(jìn)樣6次，測得其平均峰面積為6.539，RSD為0.26%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

A：黃芩苷對照品；B:咽舒康口服液樣品；C陰性對照樣品。

圖4 HPLC專屬性

3.5 重復(fù)性試驗 取咽舒康口服液(批號:20160912)6份，按照供試品制備方法制樣，分別測定。測得其平均含量為9.8998 g/L，RSD為1.8%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.6 樣品穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號:20160912)溶液，按照“3.1”色譜條件，在配制后0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣測定峰面積，測得其平均值為5.981，RSD為0.5%(n=8)，顯示出該咽舒康樣品溶液穩(wěn)定。

3.7 加樣回收試驗 精密移取批號為20160912的咽舒康口服液(含量9.8998 g/L)6份(每份1 mL)置于50 mL的量瓶中，加入儲備液4 mL(濃度2.8047 g/L)，用甲醇定容，搖勻。于20 mL容量瓶中加入上述液1 mL，甲醇定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，按“3.1”色譜條件，分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算回收率，平均回收率為102.12%，RSD=1.06%,(n=6)，可見此方法測定黃芩苷回收率較高，準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

取樣量/mL樣品量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%19.899811.218821.2722101.3719.899811.218821.2861101.4919.899811.218821.4771103.20102.121.0619.899811.218821.2006100.7319.899811.218821.4007102.5119.899811.218821.5014103.41

3.8 樣品含量測定 將三個批次(批號：20160912、20160914、20160916)的咽舒康口服液進(jìn)行含量測定，結(jié)果分別為9.74、10.18、8.59 g/L。

4 討論

4.1 薄層色譜條件的選擇優(yōu)化

4.1.1 本文對處方中全部藥味均進(jìn)行了薄層鑒別的試驗，但只能將黃芩、青果及玄參進(jìn)行有效的分離鑒定，其余藥味存在主斑點分離不開、陰性干擾等，所以僅將黃芩、青果和玄參的薄層鑒別暫時納入本質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之中。依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，最終確定本方中所做的薄層色譜法中目標(biāo)成分分別為：黃芩鑒別的是黃芩苷，玄參鑒別的是哈巴俄苷，青果鑒別的是香豆素。

4.1.2 對黃芩的鑒別中，最初采用冰醋酸-水-正丁醇(1∶2∶7)為展開劑，但存在展開速度慢、拖尾及背景干擾等缺點。經(jīng)摸索，以水-乙酸乙酯-丁酮(1∶5∶3)作為展開劑時，分離度等指標(biāo)較好，但仍存在拖尾，因此在展開劑中加入少許甲酸，拖尾現(xiàn)象得到改善，最終展開劑為水-乙酸乙酯-甲酸-丁酮(1∶5∶1∶3)，該色譜條件分離黃芩主斑點的效果較好。

4.1.3 對于處方中玄參的鑒別，按照藥典及其他文獻(xiàn)的方法發(fā)現(xiàn)存在較大干擾，將其方法進(jìn)行梳理整合后采用酸解，乙酸乙酯提取，樣品雜質(zhì)較少，操作簡單。

4.2 液相色譜條件的選擇優(yōu)化

4.2.1 考慮到樣品中黃芩苷能否得到充分的提取，本試驗對同一批次的樣品進(jìn)行如下兩種不同處理方法的比較：超聲(0、10、20、30 min)、提取溶劑(甲醇、乙醇)。測定結(jié)果表明超聲提取對其含量無明顯影響，而不同的提取溶劑對其有影響，且甲醇高于乙醇。故此次對黃芩苷的提取條件是甲醇溶解，混勻即可，該提取方法方便簡單，利于實驗的操作。

4.2.2 流動相的選擇 本次分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液(濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)、乙腈-水系統(tǒng)為流動相時含量測定，以峰高、分離度、重復(fù)性、拖尾因子、不對稱度等作為考察指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動相不管是甲醇-水還是乙腈-水，在色譜圖中均有拖尾顯現(xiàn)。結(jié)合以往經(jīng)驗，我們在水相中加入一定量磷酸，結(jié)果顯示色譜的峰形和拖尾均得到改善。但考慮到乙腈的成本較甲醇高，所以此次用甲醇-磷酸溶液作為流動相，同時此次對不同濃度的磷酸溶液進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，隨著磷酸濃度的增加，對峰形無明顯影響，但是隨著濃度的增加酸度增強(qiáng)，對色譜柱的損傷性也在增大且該損傷是不可逆的，最終本次實驗采用了甲醇-0.1%的磷酸溶液作為流動相，效果較好。

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