皖南蝮蛇抑瘤組分Ⅰ對人胃癌SGC-7901細(xì)胞作用機(jī)制的初步探討

趙 容，盧林明，張根葆，柴 琳，周 玨

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室；3.口腔醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

胃癌是全球常見腫瘤之一，占全世界病死率的第二位[1]，我國胃癌發(fā)病率占全球的42.7%,且我國胃癌的發(fā)病率及病死率均占所有惡性腫瘤的前三位[2]。由于胃癌早期癥狀往往并不明顯，大多患者就診時已是胃癌晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，所以尋求新一代天然安全高效的抗腫瘤藥物成為我們進(jìn)一步延長患者生命、提高患者生存質(zhì)量的重要課題[3-4]。蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，成分復(fù)雜，主要含蛋白質(zhì)、多肽及一些酶類，具有廣泛的生物學(xué)活性，可作為天然的藥用資源。蛇毒可導(dǎo)致神經(jīng)和細(xì)胞毒性，水腫，血小板減少癥和血液凝固因子的損害，并存在可以損害細(xì)胞完整性的l-氨基酸氧化酶和解聯(lián)蛋白，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,蛇毒對多種腫瘤等都有較好的抑制作用[5-8]。皖南蝮蛇毒抑瘤組分Ⅰ(Agkistrodonhalysvenom antitumor component-Ⅰ,AHVAC-Ⅰ)是由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所通過改良蛇毒分離純化技術(shù)，從皖南產(chǎn)蝮蛇蛇毒中提取的一種抑瘤組分，前期課題組發(fā)現(xiàn)AHVAC-Ⅰ對胃癌細(xì)胞株的作用機(jī)制可能通過誘導(dǎo)凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖[8],因線粒體凋亡途徑是重要的凋亡方式之一，故本實(shí)驗(yàn)選擇探討線粒體凋亡途徑在AHVAC-Ⅰ對胃癌細(xì)胞株的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 人胃癌細(xì)胞SGC-7901的體外培養(yǎng) 試劑及藥品： AHVAC-Ⅰ干凍粉由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(凱基生物Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青公司)、青霉素-鏈霉素溶液、胰酶消化液、MTT試劑盒(美國Sigma公司)、JC-1線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)(碧云天生物技術(shù)公司)。RPMI培養(yǎng)基與胎牛血清按9∶1的比例配制細(xì)胞培養(yǎng)液(按雙抗說明書建議比例滴加雙抗)，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们坝?7℃復(fù)溫。細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化1∶2傳代，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，每隔1～2 d換液、傳代，至對數(shù)增長期，收集細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2 MTT法篩選AHVAC-Ⅰ對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響 選擇傳代培養(yǎng)第3～5代生長速度快、形態(tài)好的SGC-7901細(xì)胞常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/mL，按每孔200 μL的量均勻接種于96孔板中，培養(yǎng)箱孵育過夜。將AHVAC-Ⅰ干凍粉溶解于培養(yǎng)液中，稀釋、配制成各濃度 AHVAC-Ⅰ(3、5、10、20、30 mg/L)，設(shè)空白對照組、正常對照組，每孔設(shè)5復(fù)孔。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后各孔中加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸掉上清液，向每孔中加入150 μL DMSO，在水平振蕩儀上避光振蕩10 min，酶標(biāo)儀在波長490 nm處進(jìn)行檢測。計(jì)算AHVAC-Ⅰ各個濃度作用24 h對細(xì)胞的增殖抑制率(inhibition ratio,IR)，計(jì)算公式：IR=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照孔OD值-調(diào)零孔OD值)]×100%。

1.3 JC-1檢測△Ψm改變 設(shè)置正常對照組，3、10、20 mg/L AHVAC-Ⅰ培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h。按JC-1說明書加入JC-1工作液37℃避光孵育20 min，洗凈。多功能酶標(biāo)儀設(shè)置檢測單體時激發(fā)光為490 nm,發(fā)射光為530 nm；檢測聚合物時激發(fā)光為525 nm,發(fā)射光為590 nm。計(jì)算紅光/綠光的熒光強(qiáng)度變化。

2 結(jié)果

2.1 MTT 如圖1、表1示，在24 h時實(shí)驗(yàn)組隨AHVAC-Ⅰ濃度的增加(3～30 mg/L)細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20 mg/L組與30 mg/L組對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，故選擇3、10、20 mg/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。

AHVAC-Ⅰ/(mg/L)24hOD值IR/%空白組0.155±0.013-正常對照組0.547±0.044a-30.463±0.006b0.15250.403±0.022c0.263100.315±0.010d0.423200.202±0.034e0.630300.163±0.022e0.701F162.463-P0.000-

注：字母不同代表組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),字母相同代表組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 AHVAC-Ⅰ對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制的影響

2.2 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)改變 正常對照組細(xì)胞貼壁生長，且貼壁較為緊密，形態(tài)為不規(guī)則多邊形，核分裂像較多。經(jīng)AHVAC-Ⅰ處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察到隨濃度增加細(xì)胞密度逐漸稀疏，細(xì)胞懸浮、固縮等凋亡現(xiàn)象逐漸增加。低濃度組的形態(tài)基本是多邊形，但可以看見細(xì)胞邊緣變亮，細(xì)胞的貼壁率有所下降；中濃度時可見細(xì)胞固縮變圓，體積縮小，細(xì)胞間隙變大，出現(xiàn)凋亡小體；而高濃度組可見細(xì)胞抱團(tuán)體呈現(xiàn)小、圓、亮的特征，可見較多的凋亡小體。詳見圖2。

A:正常對照組;B:5 mg/L組;C:10 mg/L組;D:20 mg/L。

圖2 AHVAC-Ⅰ處理24 h后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化(×400)

2.3 AHVAC-Ⅰ處理6 h后SGC-7901細(xì)胞△Ψm變化 酶標(biāo)儀檢測分析低、中、高濃度組JC-1聚合物/JC-1單體依次是 (0.713±0.044)、(0.492±0.082)、(0.374±0.033)，可以看出與對照組(1±0.075)比較，AHVAC-Ⅰ處理6 h后實(shí)驗(yàn)組的△Ψm均降低(P<0.01)，隨AHVAC-Ⅰ濃度的增加(3～20 mg/L)△Ψm逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.29,P<0.05)。詳見圖3。

AHVAC-Ⅰ不同濃度組與對照組比較P<0.01；字母不同代表組間比較P<0.05。

圖3 AHVAC-Ⅰ處理6 h后SGC 7901細(xì)胞△Ψm變化

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序死亡的方式，目前主要有三條已知的途徑，即死亡受體途徑，線粒體凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，而早在20世紀(jì)90年代中期，線粒體在凋亡途徑中的中心地位就得到了認(rèn)可[9]?！鳓穖的改變是線粒體凋亡途徑的早期事件，檢測△Ψm的變化可以反映PTP孔開放的情況。△Ψm的下降反映PTP孔的異常開放，PTP孔的異常開放引起線粒體促凋亡蛋白(如Cyt-c、AIF等)釋放，激活Caspase-9酶的活性形成的凋亡復(fù)合體，進(jìn)一步激活有死亡蛋白酶稱號的Caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡[10-11]。JC-1是一種廣泛用于檢測△Ψm的理想熒光探針，本實(shí)驗(yàn)選用JC-1檢測試劑盒檢測AHVAC-Ⅰ對SGC-7901細(xì)胞△Ψm的影響，發(fā)現(xiàn)隨著AHVAC-Ⅰ濃度的增加(3～20 mg/L),細(xì)胞形態(tài)學(xué)呈明顯的凋亡特征，△Ψm從(0.713±0.044)下降到(0.374±0.033)，說明AHVAC-Ⅰ對SGC-7901的促凋亡作用與△Ψm的下降呈正相關(guān)。而此線粒體凋亡途徑的具體機(jī)制以及是否還有其他凋亡途徑的參與尚需要進(jìn)一步的研究探討。

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