HPLC法同時測定五味子糖漿中五味子酯甲和五味子甲素的含量

宋 博，孫玉坤，田 潔，宋 旸，唐 哲，姚 輝，王海鵬

HPLC法同時測定五味子糖漿中五味子酯甲和五味子甲素的含量

宋 博1，孫玉坤1，田 潔2，宋 旸3，唐 哲1，姚 輝1，王海鵬1

目的建立HPLC法測定五味子糖漿中五味子酯甲和五味子甲素含量的方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Eclipse Plus C18柱(3.5 μm，4.6×100 mm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(60∶40)進行梯度洗脫；流速1.2 ml/min；檢測波長254 nm；柱溫26 ℃。結(jié)果五味子酯甲的進樣量在1.04～26.23μg范圍內(nèi)(r=0.9991)、五味子甲素的進樣量在1.05～26.51 μg范圍內(nèi)(r=0.9995)線性關(guān)系良好，五味子酯甲、五味子甲素的平均回收率分別為99.58% (RSD=1.72%，n=6)和99.95% (RSD=1.29%，n=6)。結(jié)論本方法簡便快捷，重現(xiàn)性好，結(jié)果準確，適用于五味子糖漿的含量測定。

五味子糖漿；五味子酯甲；五味子甲素；HPLC；含量測定

五味子糖漿收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第2冊[1]。五味子是華中五味子或木蘭科植物五味子的干燥成熟果實。習(xí)慣稱前者為“南五味子”，后者為“北五味子”。性酸、甘、溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心之功效[2]。木脂素為五味子的主要活性成分，同時還含有揮發(fā)油和多糖等成分。據(jù)相關(guān)研究報道，五味子多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、保肝、抗腫瘤、抗衰老等作用[3-5]。文獻[6-9]多報道單獨檢測五味子甲素或五味子醇甲在五味子糖漿中的含量，并以此作為五味子糖漿的質(zhì)控標準。本實驗在既有方法的基礎(chǔ)上，通過反復(fù)摸索，成功運用了HPLC法同時測定五味子糖漿中五味子酯甲和五味子甲素的含量，為較好地檢測該產(chǎn)品質(zhì)量提供了一條更為精準、可操作的實驗方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國賽默飛世爾-Accela高效液相色譜儀，四元泵系統(tǒng)，紫外檢測器為SPD-10B型；北京卓川WA.167-uw實驗室超純凈水器；BK-4799JC型數(shù)控超聲波清洗器(上海越眾)；750G多功能粉碎機(上海尚層工貿(mào)有限公司)；JA1005電子分析天平(上海霈振儀器設(shè)備有限公司，萬分之一)；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司)；2020AB恒溫干燥箱(阿斯卡利)。

1.2 藥品與試劑 對照品均來自上海樊克生物科技有限公司，分別為五味子酯甲(47529-51-3) 對照品和五味子甲素(83083-25-6)對照品。五味子糖漿檢測樣品均為藥店銷售的產(chǎn)品(生產(chǎn)廠家一致，批號分別為國藥準字Z20151682、20152751、20152019、20151437、20162083、20162431)。甲醇為AR分析純(南京化學(xué)試劑股份有限公司)；乙腈(≥99.9%，SIGMA-ALDRICH)；超純水由EasyQ-A20型超純水儀制備(上海技舟化工科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用Eclipse Plus C18柱(3.5 μm，4.6×100 mm)為色譜柱；流動相(梯度洗脫液)為乙腈-0.1%磷酸水溶液(60∶40)；檢測波長為254 nm；柱進樣量為20 μl；溫控制在26 ℃；流速為1.2 ml/min。

2.2 復(fù)合對照品溶液制備 精密稱定0.0107 g五味子酯甲和0.0104 g五味子甲素，置于10 ml 的容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻后既得復(fù)合對照品溶液(五味子酯甲1.07 mg/min，五味子甲素1.04 mg/ml)。

2.3 供試品溶液制備 精密吸取10 ml五味子糖漿溶液，加水稀釋至20 ml，每次以30 ml氯仿作為提取液，共提取3次，將收集到的氯仿溶液蒸發(fā)后得殘渣，移至容量瓶(10 ml)中，再加入甲醇溶解并定容至刻度，混合均勻后經(jīng)微孔濾膜濾過，獲得的濾過液即為本實驗的供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 取單糖漿根據(jù)五味子糖漿的配方和供試品溶液的制備方法制備不含五味子的陰性樣品對照溶。將以上制得的三種試液各進樣20 μl，按上述色譜條件檢測并記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示，陰性樣品無雜質(zhì)干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取復(fù)合對照品溶液(2、4、8、15、20、25、30 μl)依次進樣，按上述色譜條件測定并記錄峰面積，以進樣量對峰面積制作標準曲線，得出五味子酯甲的回歸方程為Y=2×106X-801006，r=0.9993，其在1.04～26.23 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；五味子甲素的回歸方程為Y=2×106X-214367，r=0.9995，其在1.05～26.51 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 儀器精密度試驗 精密吸取復(fù)合對照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，每次20 μl，測得五味子酯甲、五味子甲素峰面積的RSD值分別為1.09%和1.15%，可滿足實驗要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗 吸取五味子糖漿(批號：20151682)6份，按供試品溶液制備方法制備溶液，按上述色譜條件，依次于0、2、4、6、8、12、24 h各進樣20 μl，并記錄峰面積，分別得出五味子酯甲、五味子甲素的RSD值為1.12%和0.96%，說明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 吸取五味子糖漿(批號：20151682)6份，按供試品溶液制備方法制備溶液，按上述色譜條件，每次各進樣20 μl，依次測定，結(jié)果為五味子酯甲質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1.10%，五味子甲素質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1.01%。

2.9 加樣回收率試驗 吸取五味子糖漿(批號：20151682，含量已知)6份，每份10 ml，分別置于50 ml量瓶中，將五味子酯甲和五味子甲素對照品精密稱取適量加入容量瓶，按上述“2.2”項方法處理，制得供試品溶液。分別測得五味子酯甲和五味子甲素的平均回收率(n=6)為99.58%和99.95%，RSD值為1.72%和1.29%(表1)。

表1 五味子兩種指標的加樣回收率 (n=6)

2.10 樣品的測定 量取6批次五味子糖漿樣品適量，依照“2.2”項下方法處理并制備供試品溶液，按上述色譜條件下各進樣20 μl測得峰面積，計算五味子酯甲和五味子甲素的含量(表2)。

表2 五味子樣品含量測定 (mg/ml;n=6)

3 討 論

本研究分別考察了幾種提取方式，發(fā)現(xiàn)采用氯仿提取3次(每次20 ml)，合并氯仿液，為提取五味子酯甲和五味子甲素的最優(yōu)化方法。

3.1 流動相系統(tǒng)選擇 以往文獻報道使用甲醇-水為流動相居多，也有使用甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水作為流動相的，本研究通過應(yīng)用乙腈-0.1%磷酸作為流動相，與以上條件的對比發(fā)現(xiàn)五味子糖漿中的兩種指標分離效果與流動相的酸堿度存在相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用乙腈-0.1%磷酸作為流動相使得兩種待測成分與另外不相關(guān)物質(zhì)達到理想的分離度和峰形。通過實驗發(fā)現(xiàn)，根據(jù)五味子酯甲和五味子甲素極性偏小的特點，可通過快速增加有機相的比例使兩種成分達到較理想分離效果。

3.2 檢測波長的優(yōu)化 本研究在上述液相色譜條件下，通過應(yīng)用紫外可見吸收檢測器對供試品溶液和對照品溶液光譜掃描，范圍為200～400 nm并繪制三維吸收圖譜，結(jié)果在254 nm處兩種檢測成分均有較大吸收強度，而其他雜質(zhì)峰在此波長處無明顯吸收。

綜上所述，本研究通過對樣品的提取方法，流動相系統(tǒng)的選擇，及檢測波長的優(yōu)化，成功完成了同時對五味子糖漿中的兩種主要成分(五味子酯甲和五味子甲素)的含量檢測，此方法具有穩(wěn)定性好、可操作性強等特點，以期為五味子糖漿的質(zhì)量檢測提供一條新的途徑。

【參考文獻】

[1] 國家藥典委員會. 中國藥品標準中藥成方制劑[S].第二冊:37.

[2] 劉秋麗, 左冬冬. 五味子糖漿中五味子醇甲含量測定[J].中醫(yī)藥信息，2010,27(3):63-65.

[3] 冷 秋，張 鵬，黃莉莉，等. 五味子藥理作用研究進展[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2006，34(4)：51-53.

[4] 閆 舒，仰榴青，趙 婷，等. 五味子多糖的最新研究進展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009,19(4)：366-368.

[5] 許方敏,薛 瑞,葉洪濤,等，五味子醇甲對小鼠抑郁樣行為的影響[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2017，31(3):244-249.

[6] 張彥東,余少婷,王麗菊. HPLC測定五味子糖漿中五味子甲素的含量[J].中藥材，2005,28(8):727-728.

[7] 張朝民,黃海欣,張玉潔. 五味子糖漿質(zhì)量標準研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2005,11(6):18-19.

[8] 馬平勃,黃中偉. 五味子糖漿含量測定的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2003,14(6):323.

[9] 盧德剛,姚洪艷. HPLC法測定五味子糖漿中五味子醇甲的含量[J].黑龍江醫(yī)藥,2008,21(4):6-7.

(2017-11-14收稿 2018-01-23修回)

SimultaneousdeterminationofschisantherinanddeoxyschizandrininWuweizisyrupbyHPLC

SONG Bo1,SUN Yukun1,TIAN Jie2, SONG Yang3,TANG Zhe1, YAO Hui1, and WANG Haipeng1.1.Liaoning Provincial Crops Hospital,Chinese People’s Armed Police Force,Shenyang 110034,China. 2. Chinese Medicine Hospital of Tangshan,Tangshan 063000, China. 3.Medical Team, Troop 93321 of PLA,Shenyang 10031, China

ObjectiveTo establish a method for the determination of schisantherin and deoxyschizandrin in Wuweizi syrup.MethodsThe high performance liquid chromatography method was used and the separation was performed on an Eclipse Plus C18(3.5 μm,4.6×100 mm)with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution(60∶40) as the mobile phase with gradient elution at a flow rate of 1.2 ml/min. The detection wavelength was set at 254 nm, and the column temperature was 26 ℃.ResultsThe linear range of schisantherin and deoxyschizandrin was 1.04-26.23 μg (r=0.9991) and 1.05-26.51 μg (r=0.9995)respectively. The average recovery was 99.58% (RSD=1.72%，n=6) and 99.95% (RSD=1.29%，n=6), respectively.ConclusionsThe established HPLC method is proved to be simple, reproducible, precise and suitable for the content determination of Wuweizi syrup.

Wuweizi syrup；schisantherin；deoxyschizandrin；HPLC；content determination

宋 博，學(xué)士，主管藥師。

1.110034 沈陽，武警遼寧總隊醫(yī)院藥劑科；2.063000，唐山市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部；3.110031 沈陽，解放軍93321部隊衛(wèi)生隊

孫玉坤，E-mail:wjsunyk@163.com

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尤偉杰)