蛋白激酶在大鼠缺血及再灌注腦損傷中的調(diào)節(jié)作用

許 忠，何曉飛，徐 凱，徐如祥

蛋白激酶在大鼠缺血及再灌注腦損傷中的調(diào)節(jié)作用

許 忠1，何曉飛1，徐 凱1，徐如祥2

目的探討蛋白激酶在大鼠缺血及再灌注腦損傷中的調(diào)節(jié)作用。方法孕18 d SD大鼠，取胚胎大鼠海馬并分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，加阿糖胞苷抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖以純化神經(jīng)元，隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組缺血時(shí)間設(shè)定為30 min與60 min，采用Western blot檢測(cè)蛋白激酶C活性及蛋白表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組缺血30 min和缺血60 min神經(jīng)元胞漿PKC活性分別為(6.24±0.27)pmol/(min·mg)、(3.26±0.21)pmol/(min·mg)和(3.05±0.17)pmol/(min·mg)，胞膜PKC活性為(2.63±0.13)pmol/(min·mg)、(8.85±0.32)pmol/(min·mg)和(10.63±0.35)pmol/(min·mg)，缺血神經(jīng)元胞漿PKC活性較正常明顯下降，胞膜PKC活性明顯增加；缺血再灌注損傷后，其胞漿PKC活性分別為(0.97±0.19)pmol/(min·mg)和(0.82±0.16)pmol/(min·mg)，胞膜PKC活性為(12.38±0.39)pmol/(min·mg)和(12.66±0.99)pmol/(min·mg)，上述改變依然存在并較前者明顯。PKCα表達(dá)亦呈現(xiàn)上述相似的改變。所有改變均隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論缺血損傷與PKC的移位激活密切相關(guān)，缺血損傷所致的Ca2+超載為其中心環(huán)節(jié)。

腦缺血；再灌注損傷；蛋白激酶

腦缺血或創(chuàng)傷后興奮性氨基酸過度釋放和激活，興奮性毒性作用及其所致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是引起神經(jīng)細(xì)胞延遲性凋亡，并導(dǎo)致繼發(fā)性腦損害的重要原因[1，2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，AMPA受體的GluR2亞單位在阻斷Ca2+通透過程中起著關(guān)鍵作用[3]。迄今，有關(guān)AMPA受體GluR2亞單位的研究已很多，但仍有諸多機(jī)制需要深入探討，如：胞膜表面功能性GluR2亞單位數(shù)目是如何改變的？是否受GluR2蛋白總量或代謝過程調(diào)節(jié)？AMPA受體其他亞單位如何變化？尤為需要關(guān)注的是，上述改變與蛋白磷酸化之間存在何種聯(lián)系。本研究旨在借助Western blot檢測(cè)技術(shù)探討蛋白激酶的調(diào)節(jié)作用，為深入闡明缺血腦損害發(fā)生的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取孕18 d SD大鼠，斷頭處死，采用體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇消毒腹部，取出胚胎，剪取胎腦，解剖顯微鏡下分離雙側(cè)海馬，冰D-Hank液洗2次，剪碎，質(zhì)量濃度為1.25 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，血清中止消化，離心800 r/min，10 min，棄上清，加種植培養(yǎng)液(含質(zhì)量濃度為200 g/L FCS的DMEM)4 ml，用吸管輕柔吹打，篩網(wǎng)過濾，以1×106/L細(xì)胞數(shù)種植于塑料培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿預(yù)置經(jīng)0.1 g/L多聚賴氨酸處理的蓋玻片)，每個(gè)培養(yǎng)皿加培養(yǎng)液2 ml，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。第3天，在培養(yǎng)液中加入Ara-c10 μmol/L，24 h后更換新的培養(yǎng)液(含NGF 25 μg/L)，以后每隔3～4 d更換一次培養(yǎng)液。

1.2 模擬缺血損傷 體外培養(yǎng)12 d，從CO2培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，生物安全柜內(nèi)吸去培養(yǎng)液，添加預(yù)先去氧的無(wú)糖細(xì)胞外液(ECS-OGD)，主要成分為116 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1.0 mmol/L NaH2PO4，1.8 mmol/L CaCl2，36 mmol/L NaHCO3，33 mmol/L Sucrose，迅速置入專用缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧30 min和60 min，缺氧箱內(nèi)溫度為37 ℃，氣體成分的體積分?jǐn)?shù)分別為：0.85 N2, 0.10 H2, 0.05 CO2。分別于缺血后30 min和60 min取出恢復(fù)正常細(xì)胞外液培養(yǎng)24 h。

1.3 腦缺血損傷致PKC移位激活 (1)胞漿與胞膜蛋白提?。悍謩e取正常培養(yǎng)(對(duì)照組)及模擬缺血培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元(實(shí)驗(yàn)組)，離心，600 r/min，10 min，用D-Hank液洗滌1次后，離心去上清，加入1 ml勻漿液[20 mmol/L Tris ·Cl, 0.25 mol/L Sucrose, 10.0 mmol/L EGTA, 2.0 mmol/L EDTA, 20 μg/ml Leupeptin(亮抑酶肽)，1 mmol/L PMSF , pH 7.5]制作勻漿， 4 ℃離心，100 kg×60 min，上清液即為粗提的胞漿提取物，沉淀加勻漿液(含1 % TritonX 100)4 ℃攪拌30 min；超速4 ℃離心，100 kg×60 min，上清液即為粗提胞膜成分。(2)PKC活性測(cè)定：用中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)制的PKC活性檢測(cè)試劑盒， PKC活性的計(jì)算：用1 μl(γ-32P)-ATP做總計(jì)數(shù)值(Bq)，用以下公式計(jì)算PKC的活性。PKC活性=(反應(yīng)管Bq-對(duì)照管Bq)×100/(Bq)×樣品蛋白含量(mg)。(3)PKC提取物蛋白含量測(cè)定：取PKC提取物0.5 ml，紫外分光光度計(jì)用280和260 nm波長(zhǎng)測(cè)光密度值(Dλ)，根據(jù)公式(1.45×D280nm-0.74×D260nm)×稀釋倍數(shù)，可測(cè)得蛋白含量(mg)。(4)PKCα移位激活(western blot)：分別取胞膜蛋白100 μg作8 %SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，7 %的脫脂奶粉-PBST溶液室溫封閉1 h。洗膜后分別加入7 %脫脂奶粉-PBST溶液配制的PKCα單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜孵育，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG雜交，加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度分析，強(qiáng)度以吸光度與面積的乘積來表示(A×mm2)。

2 結(jié) 果

2.1 腦缺血損傷致PKC移位激活 體外模擬缺血可致大鼠海馬神經(jīng)元胞漿PKC活性明顯下降，并隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。與此同時(shí)，胞膜PKC活性明顯增加，同樣隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其活性更高。恢復(fù)氧供應(yīng)24 h，上述情況依然存在(表1)。

表1 體外模擬缺血損傷大鼠海馬神經(jīng)元PKC活性變化 (pmol/min·mg;n=10；

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與缺血30 min比較，②P<0.05；與缺血60 min比較，③P<0.05

2.2 缺血損傷后PKCα的變化 體外模擬缺血損傷后，胞膜PKCα較正常明顯增加，相對(duì)應(yīng)的，其胞漿PKCα較正常減少，其胞膜PKCα所占比例亦較正常(圖1)。缺血損傷后PKCα自胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)位增加(表2)。

圖1 缺血損傷致大鼠海馬神經(jīng)元胞膜與胞漿PKCα變化的western blot結(jié)果

(n=10；；%)

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與缺血30 min 比較，②P<0.05

3 討 論

AMPA受體的磷酸化是該受體發(fā)揮作用的主要形式。據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，多種磷酸化酶都能夠使AMPA受體發(fā)生磷酸化，如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、PKC和鈣離子依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM Dependent Protein Kinase Ⅱ,CaMK Ⅱ)等。AMPA受體的所有磷酸化位點(diǎn)均位于C末端的結(jié)構(gòu)域中，該結(jié)構(gòu)對(duì)于受體的磷酸化作用和受體功能的發(fā)揮均起著關(guān)鍵作用。GluR2的磷酸化作用主要是由PKC來完成的，其作用位點(diǎn)在GluR2 C末端的絲氨酸880位點(diǎn)處[5]。

隨著技術(shù)方法的不斷發(fā)展，有關(guān)PKC在缺血性腦損傷中的研究得以進(jìn)一步深入。PKC可分為多種亞型，如α、β、γ、δ、ζ、θ等[6]，研究表明，PKC的不同亞型對(duì)缺血的敏感程度和反應(yīng)過程是不同的[7]。本研究在顯示腦缺血損傷致PKC移位激活的同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)其移位激活隨著缺血損傷程度的加重而愈發(fā)明顯。進(jìn)一步采用western blotting技術(shù)定量神經(jīng)元研究缺血損傷后胞內(nèi)和胞膜上PKCα含量變化，結(jié)果顯示，胞膜PKCα含量較對(duì)照組顯著增加，而胞漿PKCα則低于對(duì)照組，提示缺血損傷后PKCα自胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)位增加。至此，我們驗(yàn)證腦缺血損傷可以導(dǎo)致胞膜PKC活性增加的基礎(chǔ)上，也發(fā)現(xiàn)傷后PKC從胞漿到胞膜的移位過程，結(jié)合文獻(xiàn)[8]，我們推測(cè)，突觸后膜表面AMPA受體GluR2亞單位表達(dá)水平和含量變化可能與PKCα的移位和激活存在某種相關(guān)關(guān)系。與此同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬神經(jīng)元缺血損傷后，胞膜PKCα占細(xì)胞PKCα總含量(胞膜+胞漿)的百分比也高于正常，隨缺血損傷程度的加重，該比例變化更為顯著。

PKC移位激活在腦缺血損傷中作用的可能機(jī)制。缺血損傷激活PKCα后，PKCα可通過受體結(jié)合蛋白與GluR2磷酸化位點(diǎn)(Ser880)結(jié)合，使GluR2在Ser880位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。由于GluR2的磷酸化位點(diǎn)與谷氨酸受體交互作用蛋白(GRIP)的結(jié)合位點(diǎn)是同一位點(diǎn)[9]，PKCα與GluR2的結(jié)合及其所致的Ser880位點(diǎn)的磷酸化，則可減弱GluR2與GRIP的親和力，減少突觸AMPA受體GluR2亞單位的表達(dá)和富集；同時(shí)，PKCα與GluR2結(jié)合二聚體還可阻斷GluR2亞單位與ABP和GRIP的結(jié)合，直接影響由ABP/GRIP介導(dǎo)的AMPA受體的突觸錨定。上述過程促使GluR2與錨定蛋白解離，并進(jìn)而啟動(dòng)胞吞過程，最終使得功能性AMPA受體GluR2亞單位數(shù)量減少。

再者，PKC是一種鈣/磷依賴的蛋白激酶，正常情況下，PKC幾乎以無(wú)活性的形式存在于胞漿中。缺血腦損傷所致的Ca2+超載，通過某種特定的機(jī)制激活PKC[10]?；谝暰W(wǎng)膜細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PKC對(duì)通過AMPA受體的Ca2+內(nèi)流具有調(diào)節(jié)作用[11]。由此不難看出，AMPA受體、Ca2+超載與PKC在缺血腦損傷中相互影響，而Ca2+超載為其中心環(huán)節(jié)。

總之，我們認(rèn)為，缺血損傷后PKC的移位激活直接影響GluR2突觸膜表面的錨定與解離，使膜表面受體含量減少，在調(diào)節(jié)突觸后膜表面AMPA受體GluR2亞單位的含量及功能上發(fā)揮著不可或缺的作用。

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(2017-08-06收稿 2017-12-10修回)

Modulationofproteinkinaseduringischemia/reperfusionbraininjury

XU Zhong1, HE Xiaofei1，XU Kai1, and XU Ruxiang2.1.Department of Neurosurgery, Hospital of Jiangsu Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Yangzhou 225003, China；2.Department of Neurosurgery, the Army General Hospital, Beijing 100700, China

ObjectiveTo explore the modulation of protein kinase during ischemia/reperfusion brain injury.MethodsPrimary hippocampal cultures were prepared from day-18 SD rat embryos. Hippocampal neurons were dissociated by incubation in typsin and purified with arabinosylcytosin (Ara-c), which could inhibit the proliferation of neuroglia. The postischemia time was simplified to 30 min and 60min. Changes of PKC activity in plasma and membrane were assessed by phosphoryl transfer pieces and the expression of PKCα protein was measured by Western blot.ResultsThe activities of cytosolic PKC of the control group, ischemia 30 min group and ischemia 60 min group were (6.24±0.27) pmol/(min·mg), (3.26±0.21) pmol/(min·mg) and (3.05±0.17) pmol/(min·mg)respectively, while the activities of membrane PKC were (2.63±0.13) pmol/(min·mg), (8.85±0.32) pmol/(min·mg)and(10.63±0.35) pmol/(min·mg)respectively. After ischemia/reperfusion brain injury , the activities of cytosolic PKC were (0.97±0.19) pmol/(min·mg)and (0.82±0.16) pmol/(min·mg)respectively, while the activities of membrane PKC were (12.38±0.39) pmol/(min·mg)and (12.66±0.99) pmol/(min·mg)respectively. Ischemia and reperfusion injury significantly increased the activity of membrane PKC and decreased that of cytosolic PKC. These changes became more significant with the extension of ischmia duration. Similar results were also observed in the expression of PKCα protein.ConclusionsIschemia reperfusion injury of rats’ hippocampal neurons results in translocational activation of PKC, especially PKCα, and the activation might damage the neurons by promoting calcium overload.

ischemia brain injury；reperfusion injury；protein kinase

許 忠，博士，副主任醫(yī)師。

1.225003 揚(yáng)州,武警江蘇總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)外科;2.100700 北京,陸軍總醫(yī)院神經(jīng)外科

R743

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