藏紅花及其組分對兔耳微痤瘡模型抗角化作用的研究

呂明銳，王倩然，張 銳，王孝源，汪 洋

（重慶醫(yī)科大學：1臨床醫(yī)學專業(yè)2011級；2預防醫(yī)學專業(yè)2011級；3預防醫(yī)學專業(yè)2013級；4實驗教學管理中心，重慶 400016）

痤瘡是一種最常見的發(fā)生于毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，多發(fā)生在面部和胸背部，常表現(xiàn)為粉刺、丘疹、膿皰、結節(jié)、瘢痕等。痤瘡的發(fā)病原因比較復雜，其發(fā)病機制目前尚未完全清楚，多與雄激素、皮脂分泌、痤瘡丙酸桿菌增殖、毛囊皮脂腺導管的異常角化、心理及遺傳等因素有關[1]。其中毛囊皮脂腺導管炎癥和角化貫穿于痤瘡的整個過程。藏紅花(Saffrom)為菊科植物紅花的干燥花，是我國傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥。藏紅花中明確的化學成分約200種，紅花黃色素(safflor yellow，SY)為藏紅花的主要活性成分，屬查耳酮類化合物；而羥基紅花黃色素A(hydroxy saffiower yellow A,HSYA)為紅花黃色素中含量較高的成分。臨床上利用藏紅花活血化瘀、抗菌消炎的功效，增強機體耐力，增強淋巴細胞增殖反應，以此來提高機體細胞免疫和體液免疫[2]。

角蛋白16（cytokeratin16）是角質形成細胞異常分化和過度增殖的標志,痤瘡毛囊皮脂腺導管的角質形成細胞表達角蛋白16，說明了上皮的角化過度和細胞的異常增殖。痤瘡毛囊中角化的角質形成細胞變得致密,細胞間粘附增加且不易脫落。導管角質形成細胞的增殖過度和內(nèi)皮的脫屑障礙導致角栓形成,并阻塞了毛囊口,從而誘發(fā)粉刺的形成。目前研究表明，紅花黃色素的多種藥理作用與其抑制炎癥反應有關。因此，我們建立兔耳微痤瘡模型，通過觀察藏紅花用藥前后兔耳毛囊皮脂腺導管的角質形成細胞表達角蛋白16的變化，探究藏紅花及其組分是否可改善實驗性痤瘡的癥狀，以及是否通過抗角化的作用機制產(chǎn)生治療效應。

1 材料和方法

1.1 材料

藏紅花（干），產(chǎn)地云南；兔角蛋白16 ELISA Kit（重慶韻博科技有限公司）；表皮葡萄球菌株由重慶醫(yī)科大學病原微生物室提供，經(jīng)培養(yǎng)后，用肉湯培養(yǎng)基稀釋為108個/mL備用；新西蘭兔，雄性，體重2.0～3.0 kg，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-(渝)2012-0001

1.2 方法

1.2.1 兔耳微痤瘡模型的建立[3]

新西蘭兔30只，隨機分為空白對照組、模型對照組、低濃度藏紅花組、中濃度藏紅花組和高濃度藏紅花組，每組6只。分別在新西蘭兔左、右外耳道內(nèi)側耳導管開口處約2.0 cm×2.0 cm范圍內(nèi)外用移液器涂抹50%油酸0.2 mL，1次/d，連續(xù)15 d，建立動物痤瘡模型。造模第13 d,通過肉湯培養(yǎng)基培育表皮葡萄球菌。造模第15 d，用1 mL注射器在用油酸造模的兔外耳道皮內(nèi)注射表皮葡萄球菌30 μL，并且在注射部位周圍做標記。其中空白對照組兔的雙耳均不做任何處理。

1.2.2 模型評價[4]

造模第15 d隨機取10只動物，各組2只，在左耳標記處取約1.5 cm×1.5 cm作皮膚活檢，組織塊以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，每個標本作連續(xù)切片3張，HE染色，在顯微鏡下觀察，各組切片中位置相同皮脂腺的直徑，評價造模情況。

1.2.3 藥物的準備

將干藏紅花放入1 000 mL玻璃燒杯中，利用水煎法，煮沸后靜置3 min，用濾網(wǎng)過濾掉藏紅花殘渣，配制成溶質含量分別為0.35 g（生藥）/mL，0.7 g（生藥）/mL以及1.05 g（生藥）/mL的3組不同濃度的藏紅花溶液。

1.2.4 治療

經(jīng)造模評價后，空白對照組及模型對照組按5 mL/kg/d給予超純水灌胃，低濃度藏紅花組按5 mL/kg/d給予藏紅花水提取液（含藏紅花溶質0.35 g/mL）灌胃，中濃度藏紅花組按5 mL/kg/d給予藏紅花水提取液（含藏紅花溶質0.7 g/mL）灌胃，高濃度藏紅花組按5 mL/kg/d給予藏紅花水提取液（含藏紅花溶質1.05 g/mL）灌胃。給藥頻率為1次/d,連續(xù)給藥15 d。

1.2.5 取樣

末次給藥20 h后，在注射部位標記處靜脈取血1.5 mL/管，按不同組別立即行3 000 r/min離心15 min，分離血清，利用ELISA法測定血清角蛋白16含量。同時，取右耳標記處取約1.5 cm×1.5 cm作皮膚活檢，組織塊以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，每個標本作連續(xù)切片3張，HE染色后在光鏡下觀察各組切片中位置相同皮脂腺病理形態(tài)學變化。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s（均數(shù)±標準差)表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 皮脂腺角化程度病理學觀察

光鏡下觀察HE染色結果顯示（圖1），藏紅花水提液灌胃治療前后各劑量組毛囊皮脂腺角化程度均有明顯變化。治療后第15 d毛囊面積較治療前時有明顯縮小，角質層角化過度情況有所減輕，毛囊上皮顆粒層，棘細胞層增生明顯，毛囊口和漏斗部均有角質物形成，炎癥細胞較治療前減少，表皮細胞角化層完整性逐步恢復。

圖1 各組兔耳微痤瘡模型組織形態(tài)學比較（HE染色，×100）

2.2 各組血清角蛋白16(CK16)表達

空白對照組、低濃度和中濃度藏紅花組血清CK16的表達比模型對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高濃度藏紅花組血清CK16的表達與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組兔血清角蛋白16表達的比較±s，μg/mL)

表1 各組兔血清角蛋白16表達的比較±s，μg/mL)

注：a表示與模型對照組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組低濃度藏紅花組中濃度藏紅花組高濃度藏紅花組n66666 FP CK16 0.667±0.004a 0.647±0.004 0.676±0.005a 0.673±0.008a 0.658±0.115 11.117 0.002

3 討論

痤瘡是由于毛囊及皮脂腺阻塞引發(fā)的一種慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于顏面、胸背部等皮脂腺豐富的部位。影響皮膚美觀,給患者的容貌造成負面影響，甚至可導致患者自卑、悲觀等不良情緒的產(chǎn)生，嚴重影響患者心理健康[5]。其發(fā)病一般認為與內(nèi)分泌因素(特別是雄性激素)、毛囊皮脂腺導管角化異常、微生物感染、飲食、情緒、某些化學因子及藥物等有關，但具體發(fā)病機制并不明確[6]。中醫(yī)中藥在痤瘡治療中起到一定作用。

藏紅花(carthamus tinctorius L，CT)為菊科植物紅花的干燥花，是我國傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥。現(xiàn)代藥理學實驗發(fā)現(xiàn)它具有降血壓、抗凝血、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等作用。同時還發(fā)現(xiàn)其通過抑制致炎因子表達，提升抗炎因子的表達水平，并在機體不同病理狀態(tài)下發(fā)揮抗炎作用、減輕炎癥反應、改善機體抵抗力，從而達到治療相應疾病的作用[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，角蛋白16是表皮角質形成細胞主要的結構蛋白之一,在維持細胞功能及皮膚屏障功能方面起著重要作用。角蛋白16的表達高度依賴角質形成細胞狀態(tài)和分化程度，在不同類型的上皮細胞內(nèi)表達程度也不相同。

本實驗建立兔耳微痤瘡模型，通過不同濃度藏紅花溶液灌胃觀察痤瘡治療效果。結果發(fā)現(xiàn)，藏紅花水提液組連續(xù)使用15 d后，各劑量組家兔毛囊皮脂腺導管病理學切片中可見明顯縮小的微痤瘡表皮厚度、毛囊面積及皮脂腺直徑，皮脂腺導管角化層與剛完成造模時相比，其完整性明顯恢復；且各藏紅花組的恢復情況均優(yōu)于模型對照組。提示藏紅花及其組分具有促進毛囊損傷修復的作用。此外，ELISA法測定各組皮脂腺損傷部位血清中角蛋白16（CK16）表達水平后發(fā)現(xiàn)，當藏紅花溶液濃度處于低濃度（含藏紅花溶質0.35 g/mL）及中濃度（含藏紅花溶質0.7 g/mL）時，實驗組與模型對照組存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.01），提示當藏紅花溶質濃度在0.35～0.7 g/mL這一濃度區(qū)間時,藏紅花及其組分可通過促進血清CK16蛋白表達，修復膠質細胞中的骨架蛋白，維持上皮細胞的完整性和連續(xù)性，從而達到對兔耳微痤瘡的治療作用。但高濃度藏紅花水提液未觀察到血清CK16顯著升高，推測此時對痤瘡的修復作用可能還涉及其它機制，需進一步實驗研究證實。

4 結論

綜上所述，我們通過形態(tài)學及定量實驗證實了藏紅花及其組分對兔耳微痤瘡具有明顯的療效。發(fā)現(xiàn)了藏紅花及其組分在特定濃度時能促進兔耳微痤瘡部位的皮脂腺角質形成細胞功能恢復。為臨床痤瘡的中醫(yī)藥治療提供了新的思路，同時也為藏紅花及組分在臨床治療痤瘡提供了一定的實驗依據(jù)。

1. 紀薇.痤瘡的病因病機研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2012，21（3）：528-530.

2. 李琳琳.藏紅花的研究概述[J].中山大學研究生學刊，2008，29（2）：46-52.

3. 張曉東，張國斌，張建新，等.清熱消痤顆粒對兔耳痤瘡模型的抗角化作用[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2012，24（1）：5-7

4. 張慧穎，陳賀，劉禾，等.異維A酸膠丸對兔耳微痤瘡模型的治療作用[J].實驗動物科學，2010，27（3）：22-24

5. 曾伶.榮膚血針法治療痤瘡的隨機對照研究[J].瀘州醫(yī)學院學報，2016，39（1）：57-59

6. 孫莉，李娟，顏敏，等.痤瘡發(fā)病機制研究進展[J].山東醫(yī)藥，2013，53（32）：97-100

7. 呂明銳，王倩然，楊升東，等.藏紅花及其組分抑制炎癥因子表達的研究進展[J].重慶醫(yī)學，2017，46（13）：1 850-1 853