高氧對宮內(nèi)缺氧新生大鼠海馬齒狀回血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

蔣麗雯，劉 銚，何 丹，郝 雯，李軍成，余 鴻

（西南醫(yī)科大學(xué)：1臨床醫(yī)學(xué)院2013級本科；2組胚教研室，四川瀘州 646000）

宮內(nèi)缺氧在胚胎發(fā)育期很常見，是影響胚胎發(fā)育的重要因素,通常會引起新生兒缺氧缺血性腦病，可能導(dǎo)致急性腦損傷、隨后的認(rèn)知缺陷和兒童癲癇的發(fā)生。神經(jīng)細(xì)胞對缺氧較為敏感，尤其是海馬區(qū)神經(jīng)元對缺氧極為敏感。因此，研究缺氧對海馬神經(jīng)元的影響具有重要意義。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進血管再生，故在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中VEGF具有十分重要的作用。宮內(nèi)缺氧在臨床治療上還未有特異性藥物，而高氧治療不乏為較好的一般治療措施，但其治療機制還未闡明。為此，本實驗通過建立宮內(nèi)缺氧模型，檢測宮內(nèi)缺氧后新生大鼠海馬區(qū)VEGF表達(dá)的變化，并觀察高氧治療后的VEGF表達(dá)變化，從而探討高氧對宮內(nèi)缺氧的治療作用機制，為臨床宮內(nèi)缺氧的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

體重230～260 g的15只成年雌性SD大鼠和3只成年雄性SD大鼠由西南醫(yī)科大學(xué)動物中心提供（一級實驗動物，許可證號：川實動管質(zhì)第17號）。

1.1.2 主要試劑及儀器

小鼠抗VEGF一抗、生物素化羊抗鼠二抗（SABC）試劑盒，多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）、DAB顯色試劑盒（棕黃色）均購自武漢博士德生物工程有限公司。德國Leica RM2245電動切片機，美國REV?CO公司的三氣培養(yǎng)箱，日本Olympus公司的Ax-70熒光顯微成像系統(tǒng)，Media Cybernetics公司的Im?age-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動物配種、飼養(yǎng)、分組

健康成年雌性SD大鼠15只，每只先后分別與一只雄鼠合籠飼養(yǎng)配種，第二日早晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓記為雌鼠妊娠0 d，取出雌鼠，單獨飼養(yǎng)至孕期15 d。將15只孕鼠隨機分為：對照組（CG組）、缺氧組（HG組）和高氧組（HOG組），每組5只。

1.2.2 動物造摸

自孕15 d開始將缺氧組和高氧組孕鼠置于三氣培養(yǎng)箱中（事先設(shè)置氧濃度130 mL/L，二氧化碳濃度0.3～0.4 mL/L，相對濕度 75% ～80%，溫度250C），缺氧2 h/d，連續(xù)缺氧5 d（孕15～19 d）。高氧組孕鼠每次缺氧后在正常環(huán)境生活1 h后再次放入三氣培養(yǎng)箱中（設(shè)置氧濃度500 mL/L，二氧化碳濃度0.3～0.4 mL/L，相對濕度75%～80%，溫度250C）。對照組不缺氧也不用高氧治療。3組孕鼠待其自然分娩（第21 d），每只孕鼠可產(chǎn)新生鼠5～8只。

1.2.3 取材、石蠟切片、免疫組化

每窩新生鼠隨機選取4只，取其大腦組織（每組均可得20個大腦組織），分別放入40 g/L的多聚甲醛中固定60 min。常規(guī)石蠟包埋、經(jīng)海馬冠狀切面切片（片厚4 μm），各切片作VEGF（一抗?jié)舛?∶400）免疫組化染色（SABC法），DAB顯色。

1.2.4 照相、圖像分析

應(yīng)用Olympus Ax-70熒光顯微成像系統(tǒng)對各免疫組化染色切片照相，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對每張VEGF免疫組化200倍照片均在海馬齒狀回相同視野選取相同大小的區(qū)域進行圖像分析，統(tǒng)計每張切片的陽性細(xì)胞的IOD值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料用±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，3組間的比較采用單因素方差分析，每兩組間的比較用LSD檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對照組VEGF陽性細(xì)胞胞質(zhì)染為棕黃色，細(xì)胞大而圓，在齒狀回主要分布于錐體細(xì)胞層，該層細(xì)胞主要是神經(jīng)細(xì)胞，分布較集中；與對照組相比，缺氧組VEGF陽性細(xì)胞的分布無變化，但陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組增多、染色增強，其積分光密度值增大（P＜0.05）。高氧組VEGF陽性細(xì)胞分布也與對照組相似，與缺氧組相比，數(shù)量變化不明顯，但染色明顯增強，其積分光密度值均增大（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 3組VEGF陽性細(xì)胞IOD值±s)

表1 3組VEGF陽性細(xì)胞IOD值±s)

注：a與CG組比較，P＜0.05；b與HG組比較，P＜0.05。

組別CG組HG組HOG組n 20 20 20 FP VEGF 48.37±5.29 73.65±5.94a 90.47±7.53ab 224.592 0.000

3 討 論

VEGF作為一種調(diào)節(jié)性蛋白，廣泛存在于機體多種組織、器官內(nèi)，具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用。在應(yīng)激狀態(tài)下，可通過促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增強血腦屏障對葡萄糖的通透性以及抗氧化等作用抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進神經(jīng)再生。楊瑤瑤等[1]通過采用CoC12構(gòu)建Hela細(xì)胞體外缺氧微環(huán)境模型，應(yīng)用實時熒光定量PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)人宮頸癌Hela細(xì)胞的VEGF-mRNA和VEGF蛋白的表達(dá)隨著缺氧時間（3～24 h）的增加而逐漸增加。Troll?mann等[2]研究表明，缺氧可刺激大腦皮層、海馬及胎盤缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）的表達(dá)增高。萬紹勇等[3]研究發(fā)現(xiàn)新生兒發(fā)生窒息所致新生兒大腦缺氧、缺血后，腦組織中VEGF水平明顯升高，且因新生兒血腦屏障發(fā)育還不完善,故VEGF能夠較早地釋放入血。也有研究表明，在新生大鼠急性缺血缺氧后，大鼠大腦側(cè)腦室會出現(xiàn)短時間內(nèi)上調(diào)的 VEGF 表達(dá)[4]。最近，SatriotomoI等[5]研究發(fā)現(xiàn)，急性間歇性缺氧可增強脊髓非呼吸運動神經(jīng)元VEGF的免疫活性，并提示急性間歇性缺氧可能成為治療脊髓損傷和運動神經(jīng)元疾病等的治療手段；Rodriguez-Alvarez等[6]也發(fā)現(xiàn)，新生7 d的大鼠全腦缺氧（5%的氧氣）15 min，可致大鼠海馬體VEGF的表達(dá)增加。說明缺氧可刺激神經(jīng)組織內(nèi)VEGF的表達(dá)，而VEGF的高表達(dá)，又是神經(jīng)組織內(nèi)血管內(nèi)皮存活和增生的中心環(huán)節(jié)，從而促使神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞再生，因此，VEGF的高表達(dá)是整個大腦缺氧缺血損傷后修復(fù)的關(guān)鍵。不僅如此，Plaschke等[7]還證實了VEGF的高表達(dá)在大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能上有保護作用。在本實驗中，胞質(zhì)染為棕黃色的VEGF陽性細(xì)胞大而圓，主要分布于齒狀回錐體細(xì)胞層，而該層細(xì)胞主要為神經(jīng)細(xì)胞；有宮內(nèi)缺氧的新生大鼠海馬齒狀回VEGF表達(dá)較對照組新生大鼠明顯增高，說明缺氧刺激所致的VEGF高表達(dá)可能是機體抵抗缺氧的一種自我保護機制，通過VEGF的高表達(dá)而刺激局部組織的血管增生、使局部神經(jīng)組織的血-腦屏障對血液中葡萄糖的通透性增高，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而達(dá)到自我保護的狀態(tài)。

圖1 3組新生大鼠海馬齒狀回VEGF表達(dá)變化（SABC法，×200）

王濤[8]的研究表明，高壓氧干預(yù)能夠?qū)崿F(xiàn)脊髓損傷大鼠脊髓組織內(nèi)VEGF的高表達(dá)，延長VEGF高表達(dá)的時間，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本實驗中應(yīng)用高氧治療后，新生大鼠海馬齒狀回VEGF表達(dá)又較缺氧組有進一步的增高，說明缺氧所致的VEGF表達(dá)增加尚不足以抵抗由于持續(xù)5 d(2 h/d)的宮內(nèi)缺氧（130 mL/L）所導(dǎo)致的神經(jīng)損傷作用，而通過高氧治療使VEGF的表達(dá)進一步增高，從而增強了神經(jīng)保護及修復(fù)作用，進一步刺激損傷區(qū)的血管發(fā)生以改善局部的缺血、缺氧環(huán)境，最終達(dá)到一種治療的效果。

4 結(jié) 論

宮內(nèi)缺氧可促進新生大鼠海馬齒狀回區(qū)VEGF的表達(dá)，高氧治療可進一步增強該區(qū)神經(jīng)組織VEGF的表達(dá)。

1. 楊瑤瑤，陳麗，龔莉，等.缺氧微環(huán)境對宮頸癌Hela細(xì)胞HIF-1α及VEGF-A表達(dá)的影響[J].西南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，40（2）：123-127.

2. Trollmann R，Strasser K，Keller S，et al.Placental HIFs as markers of cerebral hypoxic distress in fetal mice[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，295(6)：1 973-1 981.

3. 萬紹勇，明靖淞，藍(lán)照，等.關(guān)于新生兒缺氧缺血性腦病患兒VEGF、CK及CK-BB檢測的臨床價值[J].中國民康醫(yī)學(xué)，2016，28（12）：46-47.

4. Bain J M，Moore L，Ren Z，et al．Vascular endothelial growth factors-A and C are induced in the SVZ follow?ing neonatal hypoxia—ischemia and exert diferent effects on neonatal glial progenitors[J]．Transl Stroke Res，2013，4(2)：158-170．

5. SatriotomoI，Nichols NL，Dale EA.et al.Repetitive acute intermittent hypoxia increases growth/neurotrophic factor expression in non-respiratory motor neurons[J].Neuroscience，2016，322：479-488.

6. Rodriguez-Alvarez N，Jimenez-Mateos EM，Dunleavy M.et al.Effects of hypoxia-induced neonatal seizures on acute hippocampal injury and later-life seizure susceptibil?ity and anxiety-related behavior in mice[J].Neurobiol Dis，2015，83：100-114.

7. Plaschke K，Staub J，Ernst E，et al.VEGF overexpression improves mice cognitive abilities after unilateral common carotid artery occlusion[J].Exp Neurol，2008，214(2)：285-292.

8. 王濤.高壓氧干預(yù)對大鼠脊髓繼發(fā)性損傷中HIF—lα及VEGF表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，24（22）：2 403-2 405.