血漿外泌體非編碼RNA MALAT1在乳腺癌中的診斷價(jià)值

林映汐，陶華林

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000）

乳腺癌是導(dǎo)致全球女性死亡最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。從90年代起，乳腺癌發(fā)病率呈兩倍的速度增長(zhǎng)。近幾十年來(lái)，盡管乳腺癌分子生物學(xué)機(jī)制得到了廣泛研究，但在臨床上仍存在著許多問(wèn)題，如：延遲診斷、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等。因此，尋找一種更為有效的早期篩查和預(yù)后指標(biāo)成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

外泌體（exosome），一種能被幾乎所有細(xì)胞分泌的微小囊泡，直徑30～150 nm[2]，廣泛分布于血液、尿液、乳汁、腦脊液等體液當(dāng)中。人們一直認(rèn)為它是細(xì)胞的廢棄物。然而近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小囊泡中含有特殊蛋白、脂質(zhì)和核酸等，能作為信號(hào)分子傳遞給其它細(xì)胞從而改變其它細(xì)胞的功能[3]。這些發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)細(xì)胞分泌囊泡的興趣。最近研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫與疫苗的開(kāi)發(fā)、腫瘤的生長(zhǎng)和遷移、靶向給藥等[4-6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(（long non-coding RNA，ln?cRNA)是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子,由于缺少開(kāi)放的閱讀框、蛋白質(zhì)編碼能力，曾被學(xué)者一度視為基因的“垃圾”[7]。近年來(lái)研究表明，lncRNA參與X染色體修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、小RNA的構(gòu)建等多種生理過(guò)程，且與腫瘤有著密切聯(lián)系。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）是一個(gè)長(zhǎng)度約為8 000 bp，位于染色體11q13.1上，也是首次發(fā)現(xiàn)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系的長(zhǎng)鏈非編碼RNA[8]。MALAT1在人類正常組織中是廣泛表達(dá)的，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在多種惡性腫瘤異常高表達(dá)，如宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和肝癌等。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明MALAT1表達(dá)水平的上調(diào)與乳腺癌有著密切的關(guān)系，因此，MALAT1可作為乳腺癌潛在的生物標(biāo)記物。然而，血漿外泌體中MALAT1的表達(dá)水平研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)MALAT1在乳腺癌血漿外泌體中的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌臨床病理資料的相關(guān)性以及對(duì)乳腺癌的潛在診斷價(jià)值，為乳腺癌的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2016年8月至2017年4月在本院收治的乳腺癌初診的女性患者50例為病例組，均未經(jīng)手術(shù)、放療及化療，年齡在32～71歲。收集乳腺癌患者術(shù)前新鮮血漿標(biāo)本50例，包括乳腺癌侵潤(rùn)性導(dǎo)管癌45例，導(dǎo)管內(nèi)癌2例，小葉癌2例，黏液癌1例。根據(jù)2016年美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）第8版癌癥分期系統(tǒng)，分為Ⅰ期12例、Ⅱ期13例、Ⅲ期16例、Ⅳ期9例。并選取同期在本院住院期間確診為乳腺良性疾病的女性患者25例，采血前未經(jīng)任何臨床治療，年齡在21～51歲，其中乳腺纖維瘤18例，乳腺病7例。又收集同期本院女性健康者25例，年齡在24～65歲。標(biāo)本采集前均與患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與設(shè)備

exoRNeasy serum/plasma Midi Kit（德國(guó)凱杰公司）、PrimescriptTMRTⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物公司）、PCR引物（Invitrogen公司）、QuantiNova SYBR Green PCR Kit（德國(guó)凱杰公司）、7500Fast熒光定量PCR儀器（美國(guó)ABI公司）、ND-1000UV微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Nanodrop公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本處理

采集各研究對(duì)象的空腹靜脈血4mL置于EDTA-K2抗凝真空管中，收集后室溫下1 h內(nèi)以3 000 r/min離心15 min分離血漿。將分離后的血漿重新轉(zhuǎn)移至無(wú)菌無(wú)酶的EP管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 外泌體RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

按照exoRNeasy試劑操作說(shuō)明書(shū)提取血漿外泌體中RNA，將提取后的RNA進(jìn)行純度（A260/280）和完整性檢測(cè)，選取純度在1.8～2.0的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照PrimescriptTMRTⅡ試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA樣本置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 lncRNA MALAT1表達(dá)水平的檢測(cè)

選擇血穩(wěn)定表達(dá)的β-action作為內(nèi)參，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)β-action（GenBan序列號(hào)：NM-001293171.2）引物，經(jīng)BLAST測(cè)試后由Invit?rogen公司合成，引物序列：β-action上游5ˊ -TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'，下 游 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'；MALAT1 上 游5'-GACTACAGAGCCCCGAATTAATAC-3ˊ；下 游5'-CATTTTCGTCTGCGTTTAGTAAATG-3'。PCR總反應(yīng)體積為 20 μL，包括 SYBR Green PCR Master Mix(2 ×)10 μL，QNRox Reference Dye 0.1 μL，上下游引物各 2 μL，cDNA 模板 2 μL，RNase-Free Water 3.9 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)。用7500 System Software-SDS 2.2軟件在60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，并進(jìn)行熔解曲線分析。MALAT1的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算，△△Ct=△Ct病例組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-△Ct對(duì)照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。定性資料采用頻數(shù)及百分比表示分析，定量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，定性資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，定量資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)，以乳腺良性病變患者和體檢健康者作為對(duì)照組，乳腺癌患者為疾病組，采用sigmaplot 12.5軟件繪制ROC曲線，ROC曲線下面積用于評(píng)價(jià)MALAT1相對(duì)表達(dá)量對(duì)不同類型標(biāo)本的鑒別診斷價(jià)值，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體MALAT1在各組的表達(dá)

乳腺癌組血漿外泌體MALAT1表達(dá)量為[1.660（0.901,2.493）]、乳腺良性病變組表達(dá)量為[0.739（0.377,1.816）]和健康對(duì)照組表達(dá)量為[0.717（0.525,1.797）],各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.245，P=0.006)。乳腺癌組血漿外泌體MALAT1表達(dá)水平明顯高于乳腺良性病變組(Z=-2.877，P=0.004)、健康對(duì)照組(Z=-2.304，P=0.021)，見(jiàn)圖1。

圖1 血漿外泌體MALAT1在各組中相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2 乳腺癌患者血漿外泌體中MALAT1表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

對(duì)50例乳腺癌患者病理資料統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)血漿外泌體MALAT1表達(dá)水平與ER、PR、c-erbB-2、Ki-67及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、病理類型、TNM分期、P120（膜）無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表1。

2.3 評(píng)價(jià)外泌體MALAT1對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值

采用sigmaplot 12.5繪制ROC曲線分析50例乳腺癌血漿外泌體MALAT1的診斷價(jià)值。ROC曲線分析表明：MALAT1 AUCROC=0.684，當(dāng)臨界值 =0.743，敏感度=0.840，特異度=0.520，優(yōu)登指數(shù)=0.360，見(jiàn)圖2。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌血漿外泌體可穩(wěn)定表達(dá)MALAT1，其表達(dá)水平高于乳腺良性病變組及健康對(duì)照組，且外泌體MALAT1的靈敏度和特異度都較高。以上結(jié)果與國(guó)外研究報(bào)道核酸可在外泌體和血漿樣品中檢測(cè)出差異性變化結(jié)果相一致[9]。由于外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)[10]，不易被外界的各種酶所降斛，所以能很好的保護(hù)其包被的物質(zhì)。

表1 乳腺癌患者血漿外泌體MALAT1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

圖2 乳腺癌血漿外泌體MALAT1 ROC曲線

研究表明，lncRNA MALAT1在癌癥發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，MALAT1在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中過(guò)表達(dá)。同時(shí)MALAT1在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中扮演著調(diào)節(jié)作用，Guo[11]發(fā)現(xiàn)MALAT1在宮頸癌Caski48A9亞克隆細(xì)胞株中高表達(dá)，通過(guò)siRNA干擾后，G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增多而S期細(xì)胞減少，大大降低了宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)Caspase-3、Caspase-8、Bax等促凋亡蛋白上調(diào)。c-erbB-2作為乳腺癌常見(jiàn)的一個(gè)致癌基因，其表達(dá)也預(yù)示了乳腺癌患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高和5年生存率低[12]。有研究表明Ki-67表達(dá)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Ki-67表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞惡性程度高，轉(zhuǎn)移率更高[13]。P120（膜）在乳腺癌組織中也異常表達(dá)，與E-cadherin表達(dá)相關(guān)，并且與浸潤(rùn)性小葉癌的發(fā)生發(fā)展更為密切[14]。本研究結(jié)合臨床病理資料提示血漿外泌體MALAT1表達(dá)水平與ER（+）、PR（+）、c-erbB-2（+）、Ki-67（+）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，提示血漿外泌體中異常表達(dá)的MALAT1可能為 ER（+）、PR（+）、c-erbB-2（+）、Ki-67（+）乳腺癌的預(yù)測(cè)靶標(biāo)。在本研究中，乳腺癌的年齡、病理類型、TNM分期、P120（膜）與血漿外泌體MALAT1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因有可能是我們收集的樣本量有限，組間偏倚較大，后續(xù)我們將擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究血漿外泌體MALAT1水平在乳腺癌患者治療前后差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 論

血漿外泌體MALAT1有望成為乳腺癌早期篩查、診斷與預(yù)后的潛在性生物標(biāo)志物。

1. Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer inci?dence and mortality worldwide:sources,methods and ma?jor patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):359-386.

2. Colombo M，Raposo G，Thery C.Biogenesis secretion and intercellular interactions of exosomes and other extra?cellular vesicles[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2014，30:255-289.

3. Regev-Rudzki N,Wilson DW,Carvalho TG,et al.Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles[J].Cell，2013，153(5):1 120-1 133.

4. Vallabhajosyula P，Korutla L，Habertheuer A，et al,Tis?sue-specific exosome biomarkers for noninvasively moni?toring immunologic rejection of transplanted tissue[J].J Clin Invest,2017，127(4):1 375-1 391.

5. T.N.Le M，Hamar P，Guo CY，et al.miR-200-contain?ing extracellular vesicles promote breast cancer cell metas?tasis[J].Journal of Clinical Investigation，2014，124(12):5 109-5 128.

6. Kamerkar S，LeBleu VS，Sugimoto H，et al,Exosomes fa?cilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pan?creatic cancer[J].Nature，2017，546(7659):498-503.

7. Hansji H,Leung EY,Baguley BC,et al.Keeping abreast with long non-coding RNAs in mammary gland devel?opment and breast cancer[J].FrontGenet,2014，5:379

8. Ji P，Diederichs S,Wang W et al.MALAT-1,a novel noncoding RNA,and thymosin β 4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer[J].Oncogene，2003，22：8 031-8 041

9. Zhang W,Xia W,Lv Z，et al.Liquid biopsy for cancer:circulating tumor cells,circulating free DNA or exosomes[J].Cell Physiol Biochem 2017，41:755-768.

10.Liu T，Zhang X，Gao S，et al.Exosomal long noncoding RNA CRNDE-h as a novel serum-based biomarker for diagnosis and prognosis of colorectal cancer[J].Oncotar?get，2016，7:85 551-85 563.

11.Guo F ，Li Y ，Liu Y et al.Inhibition of metastasis associat?ed lung adenocarcinoma transcript 1 in CaSki human cer?vical cancer cells suppresses cell proliferation and invasion[J].Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2010，42（3）：224-229.

12.English DP，Roque DM，Santin AD． HER2 expression beyond breast cancer:therapeutic implications for gyneco?logicmalignancies[J]．MolDiagnTher，2013，17(2):85-99．

13.Yuan P，Xu BL ，Wang CZ ，et al.Ki-67 expression in lu?minal type breast cancer and its association with the clini?copathology of the cancer[J].Oncol Lett,2016，11(3):2 101-2 105.

14. Kourtidis A，Ngok SP，Anastasiadis PZ，et al.P120 catenin:an essential regulator of cadherin stability,adhe?sion-induced signaling,and cancer progression[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2013，116:409-432.