微小核糖核酸miR-449a對前列腺癌細胞凋亡的影響

李森茂，李 昂，胡 嘏，余 虓，王少剛，葉章群

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢 430030)

微小RNA(miRNA)是一種進化上保守的內(nèi)源性的小非編碼RNA，主要通過靶向結(jié)合3＇-UTR，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和蛋白的翻譯來發(fā)揮作用[1]。在過去的十幾年里，很多體內(nèi)和體外的實驗研究已經(jīng)證明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]，有些miRNA已被提出作為癌癥治療的新型潛在靶標[3]。目前為止，有研究表明miR-449a在多種腫瘤中呈現(xiàn)較低表達，包括肝癌、胃癌等，能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-5]。本實驗旨在探究miR-449a在前列腺癌組織和細胞中的表達，觀察在前列腺癌細胞株中過表達miR-449a對前列腺癌細胞凋亡的影響，并研究此過程細胞中一些凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。

1 材料與方法

1.1材料miR-449a mimics和隨機對照序列(dsControl)(廣州市銳博生物科技有限公司)；人前列腺永生化上皮細胞RWPE-1以及人前列腺癌細胞系PC3、 DU145和LnCap(中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清、Opti-MEM?無血清培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、K-SFM無血清培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)； Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、溴化丙啶(PI)(美國Invitrogen公司)；PCR引物合成、All-in-oneTMmiRNAqPCR Kit (廣州復(fù)能基因公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一抗鼠抗B淋巴細胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、一抗兔抗Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bax)、天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)(美國Affinity公司)、激活型天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)(美國Cell Signaling Technology公司)；一抗鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)、辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜；RNA酶A(美國Sigma公司)；凱基細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物股份有限公司)，Caspase3/7活細胞熒光實時法檢測試劑盒(江蘇凱基生物股份有限公司)。

1.2組織樣本及細胞培養(yǎng)前列腺癌組織標本及相應(yīng)癌旁組織標本均取于本院泌尿外科進行前列腺癌根治切除術(shù)患者的術(shù)后組織，切取標本均獲得醫(yī)院倫理委員會同意并且提前向患者本人簽署知情同意。組織手術(shù)切除后，經(jīng)具較高資格醫(yī)師指導(dǎo)下，分辨出癌組織和癌旁組織，并分別切取較小直徑組織塊，數(shù)秒內(nèi)裝入預(yù)先做好標記的凍存管，隨即放入液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱存留備用。人前列腺永生化上皮細胞RWPE-1于含0.05 mg/mL牛垂體提取物(bovine pituitary extract,BPE)及5 ng/mL人重組表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)的K-SFM無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，人前列腺癌細胞系PC3、DU145、LnCap細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.3dsRNA、miRNA序列的選擇和細胞轉(zhuǎn)染dsControl是一組已知的缺少人類基因重要同源性的dsRNA，正義鏈：5′ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]3′；反義鏈：5′UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] 3′；miR-449a的序列為：3′UGGUCGAUUGUUAUGUGACGGU5′。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染時細胞融合度約為60%。根據(jù)對前列腺癌細胞的不同處理分為2組：陰性對照組(轉(zhuǎn)染dsControl)、實驗組(轉(zhuǎn)染miR-449a mimics)。接種板12 h后，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX進行轉(zhuǎn)染實驗，保證dsRNA或miRNA的終濃度為75 nmol/L。24 h后觀察細胞狀態(tài)并及時更換含血清培養(yǎng)基。

1.4總RNA的提取和qPCR分析將轉(zhuǎn)染72 h后收集的細胞以及在液氮中研磨成粉末的組織置于1.5 mL的離心管中，利用Trizol法提取細胞和組織中總RNA，然后分析細胞和組織中miR-449a的表達水平。miR cDNA合成參照廣州復(fù)能基因All-in-oneTMmiRNAqPCR Kit試劑盒說明操作，反應(yīng)條件為：①預(yù)變性：95 ℃、10 min、1個循環(huán)；②PCR擴增：共40個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性(95 ℃、10 s)、退火(60 ℃、20 s)、延伸(72 ℃、20 s)。利用MX3000P熒光實時定量PCR儀進行上述實時定量PCR反應(yīng)及檢測，U6 snRNA作為內(nèi)參。結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法分析。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡轉(zhuǎn)染72 h后，離心收集細胞，棄培養(yǎng)基；用冷PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/min，離心時間5 min收集細胞)；用200 μL 緩沖液懸浮細胞，然后分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育10 min,在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.6總蛋白的提取和Westernblot實驗轉(zhuǎn)染后72 h收集細胞用于蛋白表達的分析。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗2遍，棄上清，加入含有蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液，置于冰上(4 ℃)裂解30 min，12 000 g離心15 min收集上清。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每個樣本加25 μg蛋白至SDS-PAGE膠進行電泳，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液室溫封閉1 h后，分別與一抗鼠抗Bcl-2(1∶1 000)、兔抗Bax(1∶1 000)、兔抗Caspase-3(1∶1 000)、兔抗Cleaved caspase-3(1∶1 000)、鼠抗β-Actin(1∶500) 4 ℃孵育過夜。第2天采用羊抗鼠的二抗(1∶5 000)、羊抗兔的二抗(1∶5 000)孵育1 h，使用ECL曝光顯影。

1.7Caspase3/7活細胞熒光時實法檢測細胞凋亡情況轉(zhuǎn)染細胞72 h后，用新鮮的培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞3次，最后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，加入2 μL Caspase3/7檢測液，37 ℃避光孵育30 min,然后熒光顯微鏡下觀察并拍照計數(shù)、分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1miR-449a在前列腺癌組織及細胞系中的表達RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-449a在9對前列腺癌組織和癌旁組織中，其信使RNA的相對表達量平均值分別為(0.481±0.055)、(0.951±0.039)；miR-449a在前列腺癌組織中的表達明顯降低，與癌旁組織中表達相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。檢測前列腺上皮細胞株RWPE-1和PC3、DU145、LnCap前列腺癌細胞系中miR-449a信使RNA的相對表達量分別為(0.967±0.062)、(0.24±0.07)、(0.493±0.089)、(0.431±0.088)；與正常前列腺上皮細胞RWPE-1中miR-449a信使RNA的表達相比較，前列腺癌細胞系中miR-449a信使RNA的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，在前列腺癌組織和細胞系中，miR-449a均呈較低表達，我們選擇PC3、DU145細胞繼續(xù)后面實驗研究(圖1)。

圖1前列腺癌組織及細胞系中miR-449amRNA相對表達情況

與正常組織相比較，*P<0.05，**P<0.01；A：RT-qPCR檢測前列腺組織中miR-449a的相對表達量,橫坐標字母A～I分別表示一對正常組織和癌組織；B：RT-qPCR檢測前列腺組織中miR-449a相對內(nèi)參U6的表達量均值；與RWPE-1細胞相比較，**P<0.01，***P<0.001；C：RT-qPCR檢測各細胞中miR-449a的相對表達量。

2.2流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-449a mimics 72 h后，對照組和實驗組中PC3細胞的凋亡率分別為(4.827±0.756)%、(21.691±1.813)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.32,P<0.05)；DU145細胞的凋亡率分別為(3.79±0.72)%、(13.88±0.712)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=483.22,P<0.05)。兩組結(jié)果說明了miR-449a具有促進前列腺癌細胞凋亡的作用(圖2)。

圖2miR-449a對PC3和DU145細胞凋亡的影響

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；A：流式細胞術(shù)檢測PC3細胞凋亡；B：PC3細胞凋亡率；C：流式細胞術(shù)檢測DU145細胞凋亡；D：DU145細胞凋亡率。

2.3Caspase3/7活細胞熒光時實法檢測細胞凋亡情況結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-449a mimics 72 h后，與對照組相比較，實驗組中PC3 和DU145細胞在熒光顯微鏡下，綠色熒光強度明顯較強，說明實驗組中細胞凋亡的程度較嚴重，即說明了miR-449a具有促進前列腺癌細胞的凋亡的作用(圖3)。

圖3采用Caspase3/7活細胞熒光時實法檢測PC3和DU145不同處理組細胞的凋亡情況

(綠色熒光的強弱表示凋亡的程度，×100)

2.4Westernblot檢測各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達與對照組相比較，實驗組在轉(zhuǎn)染miR-449a mimics 72 h后，前列腺癌細胞株P(guān)C3和DU145細胞中，Bcl-2蛋白表達下降，而Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3表達上調(diào)。實驗組和對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4miR-449a對凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；A：Western blot法檢測PC3細胞中蛋白表達；B：PC3細胞中Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Bax蛋白相對表達柱狀圖；C：Western blot法檢測DU145細胞中蛋白表達；D：DU145細胞中Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Bax蛋白相對表達柱狀圖。

3 討 論

近年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)水平的提高，前列腺癌的發(fā)生率在我國呈現(xiàn)逐漸增長趨勢，愈發(fā)引起關(guān)注[6]。研究表明，多種miRNA在前列腺癌中有比較重要的作用，但是大部分與前列腺癌密切相關(guān)的miRNA還不是很明確。本研究首先通過分析檢測9對前列腺癌組織及癌旁組織中miRNA表達差異，發(fā)現(xiàn)miR-449a在癌組織中明顯降低，與文獻報道的結(jié)果較一致。我們進一步檢測了幾種常見前列腺癌細胞株和人正常前列腺上皮細胞中miR-449a的表達，結(jié)果證明了在前列腺癌細胞系中miR-449a也呈較低表達。

大量研究證實，miRNA參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等重要生物學(xué)過程，有些miRNA的表達在前列腺癌中降低，卻對靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平有較強的調(diào)節(jié)能力，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7]。NOONAN等[8]早年已經(jīng)報道了miR-449a能夠通過靶向HDAC1抑制前列腺癌細胞生長。近年又有研究表明，miR-449a也能夠增強前列腺癌對放療的敏感性，提高放療治療效果[9]。最近，有研究證實了miR-449a能夠調(diào)節(jié)前列腺癌的轉(zhuǎn)移，對早期診斷有一定的價值[10]。但是，miR-449a對前列腺癌凋亡的機制研究目前還沒有報道，本研究通過轉(zhuǎn)染技術(shù)而過表達前列腺癌細胞株P(guān)C3和DU145中miR-449a，研究其對腫瘤細胞凋亡的影響。結(jié)果表明，miR-449a明顯促進細胞凋亡，同時檢測各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白表達下降較顯著，而Bax、Caspase-3蛋白的表達卻上調(diào)了。

Bcl-2是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過抑制細胞色素C從線粒體膜間隔釋放到細胞質(zhì)中而發(fā)揮其抗凋亡功能[11]。有軟件預(yù)測Bcl-2很有可能是miR-449a的一個靶向結(jié)合基因[12]，而miRNA能夠與靶基因mRNA 3＇-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達。研究證實，miR-449a通過靶向作用Bcl-2基因，能夠促進骨肉瘤細胞的凋亡[13]，同時也能夠調(diào)節(jié)胃癌細胞的增殖和對化療藥物的敏感性[14]。有資料顯示，在多種腫瘤細胞的凋亡過程中，發(fā)現(xiàn)有Caspase的活化[15-16]，Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵性的作用，位于級聯(lián)反應(yīng)下游如Caspase-3、Caspase-7等，能被上游的始動子激活作用于特異性底物，使細胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變導(dǎo)致細胞凋亡。目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列與Caspase有關(guān)而誘導(dǎo)凋亡的方法來治療腫瘤，可望在惡性腫瘤的治療方面取得新的突破[17]。因此，我們推測miR-449a的異常表達可能與前列腺癌具有相關(guān)性，可能是通過下調(diào)靶基因Bcl-2的表達而引起B(yǎng)ax蛋白的改變，同時激活了Caspase-3蛋白的表達，最終引起了前列腺癌細胞的凋亡。當然，miR-449a可能也有很多其他的靶基因，通過改變這些個基因的表達引起細胞凋亡，這也是今后繼續(xù)研究的方向和切入點。

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