擬穴青蟹抗菌肽SCY2在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性

彭會， 劉杰， 陳慧蕓

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門361102；2.海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361102)

抗生素作為抗菌藥物是目前人類使用最廣泛的預(yù)防和治療病原微生物感染的手段之一。然而由于抗生素長期過量使用所引起的細(xì)菌耐藥性問題已成為全球公共健康問題[1－2]。尋找抗生素的有效替代品是國內(nèi)外農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?？咕氖且活悘纳矬w中分離的、具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，已證實(shí)是生物體先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分，被科學(xué)家譽(yù)為 “天然抗生素”[3－5]。 目前， 抗菌肽在細(xì)菌[6]、 植物[7]、 昆蟲[8]和脊椎動物[9]等多種生物體中均有發(fā)現(xiàn)，截至2013年，在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)報(bào)道了超過2000種抗菌肽[10]。

SCY2是從雄性擬穴青蟹Scylla paramamosain生殖腺中發(fā)現(xiàn)的一種陰離子抗菌肽，本課題組在對青蟹新型抗菌肽Scygonadin的研究過程中，在擬穴青蟹中克隆獲得了與Scygonadin具有65.08%同源性的 cDNA序列[11－12]，命名為 SCY2基因 (Gen-Bank登錄號:EF555444)。與 Scygonadin基因組DNA相似，SCY2基因組DNA同樣由3個外顯子和2個內(nèi)含子基因組成。運(yùn)用ProtParam工具分析結(jié)果顯示，SCY2成熟肽含有100個氨基酸殘基，平均相對分子量為10 925 400，等電點(diǎn)PI為4.84，為陰離子抗菌肽[12－13]。廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，SCY2是在擬穴青蟹雄性射精管顯著高表達(dá)的抗菌肽基因，交配后射精管中SCY2基因表達(dá)低于交配前，而在雌蟹陰道及納精囊中交配后SCY2基因表達(dá)量高于交配前，Western Blot與免疫熒光檢測結(jié)果證實(shí)SCY2蛋白從雄蟹體內(nèi)轉(zhuǎn)移到了雌蟹中，提示抗菌肽SCY2在交配過程中可能起到保護(hù)精子免受細(xì)菌感染的作用[13]。因此，擬穴青蟹抗菌肽SCY2可能在青蟹的生殖免疫中起著重要作用[13]。

本研究中構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K－SCY2，在畢赤酵母Pichia pastoris GS115菌株中誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，對獲得的重組蛋白純化后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜分析，同時用純化后得到的重組蛋白測定抗菌活性，以便闡明獲得的抗菌肽SCY2的抗菌活性和抗菌譜。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 真核表達(dá)用菌株、質(zhì)粒和抗菌試驗(yàn)用菌株、畢赤酵母菌株GS115、表達(dá)載體pPIC9K均購自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室制備保存。

抗菌試驗(yàn)用菌株:大腸桿菌模式株Escherichia coli、施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、弗氏志賀氏菌Shigella flexneri、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、藤黃微球菌Micrococcus luteus、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus和谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum均購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心 (CGMCC)。

1.1.2 主要試劑 HisTrapTMFF crude 5 mL購自GE公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自東盛公司；DNA Ligation Kit、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；FastPfu聚合酶購自全式金公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；胰蛋白胨、酵母粉均購自O(shè)XOID公司；瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；YNB(無氨基酵母氮源)、D－山梨醇均購自索萊寶公司；其他蛋白表達(dá)與純化相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pPIC9K－SCY2表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)pPIC9K載體多克隆位點(diǎn)和真核表達(dá)載體pPIC9KSCY2的目的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物。上游引物為F1:GGGGAATTC GGCCTGGCACTCAACAGACTTATG；下游引物為R1:ATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGTAGGAAGCAAGCCAGTCCTCGAGGTC。其中，劃線部分分別為EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)，終止密碼子前引入組氨酸標(biāo)簽，斜體部分為6×His序列。

以本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得的SCY2序列 (Gen-Bank登錄號:EF555444)為模板，F(xiàn)1和R1為上、下游引物，用FastPfu聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增SCY2目的片段。對獲得的目的片段進(jìn)行凝膠回收后，利用EcoRⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶對目的片段進(jìn)行酶切，同時對制備的pPIC9K真核表達(dá)載體同樣使用EcoRⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。使用凝膠回收試劑盒將酶切后的SCY2目的片段和pPIC9K真核表達(dá)載體分別進(jìn)行回收后，將具有相同黏性末端的SCY2目的片段和pPIC9K真核表達(dá)載體以及T4 DNA連接酶在16℃下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp的LB瓊脂平板上，于37℃下培養(yǎng)過夜。挑取單克隆PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆，并送至英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 pPIC9K－SCY2載體的轉(zhuǎn)化和鑒定 將測序正確的pPIC9K－SCY2表達(dá)載體用SacⅠ限制性內(nèi)切酶線性化，將線性化的表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于MD平板上，于28℃下培養(yǎng)2 d至產(chǎn)生單克隆，挑取單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證目的基因片段是否插入酵母基因組中，選取陽性克隆進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，保種于超低溫冰箱 (－80℃)中，以備后續(xù)表達(dá)使用。

1.2.3 抗菌肽SCY2的真核表達(dá)和純化 將保種于超低溫冰箱中的菌株GS115/pPIC9K－SCY2劃線于YPD平板，挑取單克隆接種于20 mL YPD培養(yǎng)基中，于30℃下以230 r/min振蕩培養(yǎng)約20 h至對數(shù)生長期。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入400 mL BMGY(pH 6.0)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，于30℃下以230 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，測定OD600nm達(dá)到2.0～6.0時，在室溫條件下以2000 g離心收集細(xì)胞。將離心后收集到的細(xì)胞重懸于等體積BMMY表達(dá)培養(yǎng)基中，于 28℃下以 230 r/min，用終濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)24 h，離心收集培養(yǎng)基上清液。取450 μL培養(yǎng)上清液，加入50 μL的100%三氯乙酸 (TCA)濃縮，采用SDS－PAGE電泳分析蛋白的表達(dá)量。將其余的上清液于4℃下在磷酸鹽緩沖液中透析2～3次，對透析后的上清液進(jìn)行離心，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱純化。

用5～10個柱體積 Milli－Q水清洗預(yù)裝柱(HisTrapTMFF Crude 5 mL)，接著用5～10個柱體積平衡緩沖液 (20 mmol/L磷酸緩沖液＋50 mmol/L NaCl＋10 mmol/L咪唑，pH 8.0) 平衡HisTrap層析柱，將過濾后的上清液以2 mL/min全部上柱，同時收集流穿樣品；然后用3～5個柱體積的平衡緩沖液過柱，洗去未結(jié)合的蛋白；用洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸緩沖液＋150 mmol/L NaCl＋300 mmol/L咪唑，pH 8.0)過柱，洗脫目的蛋白收集洗脫峰，取少量進(jìn)行 SDS－PAGE電泳鑒定。經(jīng)SDS－PAGE電泳后，切膠回收相對分子質(zhì)量為11 000的目的蛋白條帶，用液相分離－基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 (LC－MALDI－TOFTOF)及數(shù)據(jù)庫搜索對目的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.4 抗菌肽SCY2最小抑菌濃度的測定 最小抑菌濃度 (Minimal inhibitory concentration，MIC)的測定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行[14－15]。取被測細(xì)菌，在營養(yǎng)肉湯平板上劃線，培養(yǎng)過夜；挑取2～3個克隆接種于MH培養(yǎng)基的固體斜面，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h；用 10 mmol/L磷酸鈉鹽緩沖液 (pH 7.2)沖洗新鮮制備的MH細(xì)菌斜面培養(yǎng)物，調(diào)整OD600nm值為0.003。設(shè)置陽性對照組、空白對照組和待測樣品試驗(yàn)組。其中，陽性對照組為50 μL磷酸鈉鹽緩沖液和50 μL含MH培養(yǎng)液的菌懸液；空白對照組為50 μL待測蛋白樣品和50 μL磷酸鈉鹽緩沖液；樣品試驗(yàn)組為50 μL待測蛋白樣品和50 μL含MH培養(yǎng)液的菌懸液。

細(xì)菌在最適條件下培養(yǎng)24～48 h后，觀察MIC結(jié)果。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每種被測菌設(shè)2個平行樣。

1.2.5 抗菌肽SCY2與抗生素的協(xié)同抗菌作用試驗(yàn) 運(yùn)用棋盤法[16－17]測定抗菌肽與試驗(yàn)用抗生素之間的協(xié)同抗菌作用。連續(xù)2倍稀釋抗菌肽和抗生素的濃度為1/32MIC～1/2MIC，將稀釋后的抗菌肽和抗生素分別添加25 μL到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中與50 μL細(xì)菌混合均勻，每種被測菌設(shè)置陽性對照組、空白對照組和待測樣品試驗(yàn)組。其中陽性對照組加50 μL磷酸鈉鹽緩沖液和50 μL菌懸液；空白對照組 (抗菌肽)加50 μL待測抗菌肽樣品和50 μL磷酸鈉鹽緩沖液；空白對照組 (抗生素)加50 μL待測抗生素樣品和50 μL磷酸鈉鹽緩沖液；樣品試驗(yàn)組分別向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中順序加入25 μL 1/32×MIC～1×MIC 待測抗菌肽樣品和 25 μL 待測抗生素樣品，以及50 μL菌懸液。

在細(xì)菌最適條件下共孵24～48 h后，觀察MIC結(jié)果。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每種被測菌設(shè)2個平行樣。

抗菌肽與抗生素之間的抗菌作用可用分級抑制濃度指數(shù) (Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)來定量檢測，F(xiàn)ICI的計(jì)算公式為[16－17]

通過FICI可以得到A和B兩種試劑之間的相互關(guān)系[16－17]:當(dāng)FICI≤0.5時，A試劑和B試劑間存在協(xié)同作用；當(dāng)0.5＜FICI≤1時，A試劑和B試劑間存在增強(qiáng)作用；當(dāng)1＜FICI＜4時，A試劑和B試劑間不存在相互作用；當(dāng)FICI≥4時，A試劑和B試劑間存在拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

利用特異性引物F1和R1擴(kuò)增SCY2成熟肽基因，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴(kuò)增出一條約300 bp的條帶 (圖1－A)，與預(yù)期目的條帶大小相符。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ做雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段。表達(dá)載體pPIC9K同樣經(jīng)過EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效率 (圖1－B)，酶切前的pPIC9K質(zhì)粒為環(huán)狀，酶切后的pPIC9K為清晰且單一的條帶，長度約9 000 bp，與實(shí)際大小相符。將 PCR擴(kuò)增的SCY2目的基因用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體pPIC9K連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，重組表達(dá)載體 pPIC9K－SCY2經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、菌液PCR鑒定，得到的陽性克隆片段長度約300 bp(圖1－C)，與預(yù)期大小相符。

圖1 重組載體pPIC9K－SCY2的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of recombinant vector plasmid pPIC9K－SCY2

選擇陽性克隆送至英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAssist軟件進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，目的基因同載體的連接正確，其核苷酸的開放閱讀框 (ORF)編碼連續(xù)，與預(yù)期要表達(dá)的抗菌肽SCY2成熟肽的氨基酸序列相符合。真核重組表達(dá)載體pPIC9K－SCY2采用AOX1啟動子，酵母信號肽α－factor因子引導(dǎo)目的基因的分泌表達(dá)，在C－末端設(shè)計(jì)帶有6×His－Tag，便于對表達(dá)所得到抗菌肽進(jìn)行親和層析純化。重組質(zhì)粒載體pPIC9K－SCY2的構(gòu)建如圖2所示。

圖2 pPIC9K－SCY2重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematicrepresentation ofthevectorof pPIC9K－SCY2

2.2 SCY2在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

將pPIC9K－SCY2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115后，挑取單克隆菌株在10 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取2 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入40 mL BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到2.0～6.0時，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入等體積的表達(dá)培養(yǎng)基(BMMY培養(yǎng)基)中用0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h，結(jié)果如圖3所示。甲醇誘導(dǎo)后在相對分子質(zhì)量約11 000的位置出現(xiàn)1條蛋白相對分子質(zhì)量條帶，與預(yù)測目的蛋白SCY2分子量相當(dāng)，且在誘導(dǎo)表達(dá)12 h時即可檢測到目的蛋白SCY2的表達(dá)，在24 h已獲得高表達(dá)，之后目的蛋白表達(dá)量穩(wěn)定，且無明顯變化。

圖3 SCY2在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)Fig.3 SDS－PAGE analysis of SCY2 expression in yeast Pichia pastoris GS115

2.3 重組蛋白SCY2的純化

重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K－SCY2誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，離心去沉淀，收集胞外上清液。鎳離子螯合親和層析柱親和純化，用低濃度咪唑(10 mmol/L)洗脫雜蛋白，用高濃度咪唑 (300 mmol/L)洗脫螯合的目的蛋白SCY2，將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物、純化的流出組分和洗脫組分進(jìn)行SDS－PAGE電泳 (圖4)，結(jié)果顯示，相對分子量約11 000的SCY2重組蛋白能夠特異性地與鎳離子螯合親和層析柱結(jié)合，在較高濃度的咪唑溶液競爭洗滌后，目的蛋白SCY2被洗脫。

圖4 SCY2蛋白的純化Fig.4 SDS－PAGE analysis of the SCY2 purification

2.4 肽指紋圖譜的分析

將獲得的SCY2目的條帶切膠后用胰酶酶解，用液相分離－基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 (LC－MALDI－TOF－TOF) 鑒定后，在數(shù)據(jù)庫中搜索比對序列并進(jìn)行分析 (表1)。從表1可見:檢測到6段質(zhì)子分子量分別為1607.809 3 MH＋、2021.081 1 MH＋、 2053.961 2 MH＋、 2069.943 8 MH＋、 2246.056 9 MH＋和3027.559 3 MH＋， 其對應(yīng)于美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中SCY2前體肽 (GenBank登錄號:ABU40184.1)的位置分別為82～96、 82～100、 64～81、 64～81、 106～124和35～63。在SCY2前體肽序列中，SCY2成熟肽的對應(yīng)位置為25～124，如上質(zhì)譜檢測到的6段肽段共85個氨基酸與編碼的SCY2成熟肽序列完全相同，占SCY2成熟肽序列的85%。結(jié)果表明，獲得的目的蛋白即為擬穴青蟹抗菌肽SCY2。

2.5 重組SCY2的抗菌活性

將重組SCY2蛋白溶液分別倍比稀釋至1.6～50.0 μmol/L，與等體積的菌懸液共同孵育24 h或48 h后觀察最小抑菌濃度 (MIC)[14－15]。對8種細(xì)菌測定的MIC結(jié)果顯示 (表2)，真核表達(dá)的抗菌肽SCY2能抑制革蘭氏陽性菌的生長，對被測的革蘭氏陰性菌無抑殺活性。其中SCY2對被測的革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌具有較好抗菌活性 (MIC為12.5～25.0 μmol/L)，對藤黃微球菌、谷氨酸棒桿菌具有一定的抗菌活性 (MIC為25～50 μmol/L)；對被測的革蘭氏陰性菌無抑殺活性 (＞50 μmol/L)。

表1 SCY2酶解指紋MALDI－TOF－MS圖譜與從cDNA推導(dǎo)的SCY2前體肽序列 (GenBank登錄號:ABU40184.1)的匹配情況Tab.1 Matching of SCY2 MALDI－TOF－MS fingerprint to amino acid sequence deduced from SCY2(GenBank No.:ABU40184.1)

表2 SCY2真核重組表達(dá)產(chǎn)物的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of SCY2 expressed product in GS115

2.6 抗菌肽SCY2與抗生素的協(xié)同抗菌作用

采用液體倍比稀釋法分別對抗生素和抗菌肽進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為1/32×MIC、1/16×MIC、1/8×MIC、 1/4×MIC、 1/2×MIC、 1×MIC 的抗生素及抗菌肽，將抗生素、抗菌肽和待測菌株分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，測定了抗菌肽SCY2與青霉素、鏈霉素和四環(huán)素對大腸桿菌模式菌株、熒光假單胞菌、弗氏志賀氏菌和施氏假單胞菌的協(xié)同抗菌結(jié)果 (表3)。結(jié)果顯示，抗菌肽SCY2與四環(huán)素對熒光假單胞菌有協(xié)同抑菌作用 (FICI＝0.266)，SCY2與青霉素對施氏假單胞菌的抑殺有增強(qiáng)作用 (FICI＝0.508)。

表3 抗菌肽SCY2和抗生素對被測細(xì)菌的協(xié)同抗菌試驗(yàn)Tab.3 Minimal inhibitory concentration(MIC)and fractional inhibitory concentration index(FICI)of SCY2 and antibiotics synergistic against the test bacterial strains

3 討論

抗生素為人類的健康生存和發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)，然而抗生素的耐藥性正在以驚人的速度發(fā)展[18－20]，數(shù)月到數(shù)年的時間內(nèi)，抗生素便會在臨床上表現(xiàn)出顯著地耐藥性[21]。細(xì)菌可以通過主動外排、產(chǎn)生水解酶或鈍化酶破壞抗生素的功能結(jié)構(gòu)域、改變目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)等方式產(chǎn)生對抗生素的耐藥性[22－25]。而抗菌肽來源于生物體本身，其抗菌機(jī)理獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥性，抗菌活性強(qiáng)。抗菌肽可直接引起宿主先天性免疫應(yīng)答，并能對廣泛的病原菌做出高效而迅速的反應(yīng)，甚至對成團(tuán)細(xì)菌也起作用，因而將作其為一種新型的生物藥物替代現(xiàn)有的化學(xué)類抗生素， 具有廣闊的應(yīng)用前景[4－5，26－28]。 但直接從生物體內(nèi)提取抗菌肽過程復(fù)雜且成本高，不適于未來產(chǎn)業(yè)化的要求，目前，公認(rèn)的最有效方法是利用基因工程表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外表達(dá)。

3.1 表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)載體的選擇

為了獲得高表達(dá)量的目的蛋白，通常需要建立基因的體外高效表達(dá)系統(tǒng)。常用的體外表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，其繁殖快，可進(jìn)行規(guī)模化高密度發(fā)酵，表達(dá)量高，操作簡單，成本低廉，且蛋白翻譯后能進(jìn)行正確加工和修飾，合理的空間折疊，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性。為確定SCY2的抗菌功能，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)SCY2成熟肽編碼序列，構(gòu)建了pTrc－CKS/SCY2融合基因的原核表達(dá)載體，將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，通過變性復(fù)性和金屬鰲合層析純化獲得融合蛋白CKS－SCY2，用3C蛋白酶酶切后，純化獲得重組蛋白SCY2[12]。用該方法獲得的SCY2原核融合表達(dá)雖然表達(dá)量較高，但多以包涵體形式存在，需要進(jìn)行變性復(fù)性以及二次酶切，步驟較繁瑣，難以直接獲得大量具有天然活性的抗菌肽。因此，本研究中設(shè)計(jì)構(gòu)建了抗菌肽SCY2的真核表達(dá)載體pPIC9K－SCY2，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，易于在體外表達(dá)并獲得了大量具有天然活性的抗菌肽SCY2。

3.2 抗菌肽SCY2的抗菌活性

重組表達(dá)的SCY2的抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽SCY2對革蘭氏陽性菌，如溶壁微球菌具有較強(qiáng)的抗菌活性 (MIC＝12.5～25.0 μmol/L)， 對藤黃微球菌、谷氨酸棒桿菌具有一定的抗菌活性(MIC＝25～50 μmol/L)，對革蘭氏陰性菌無抗菌活性 (MIC＞50 μmol/L)。

SCY2雖然具有一定的抗菌效果，但并非對所有細(xì)菌都具有較好的抑殺效果。本研究中，進(jìn)一步將抗菌肽SCY2與青霉素、鏈霉素和四環(huán)素3種常用的抗生素進(jìn)行協(xié)同抗菌試驗(yàn)，抗菌試驗(yàn)的菌株為大腸桿菌模式菌株、熒光假單胞菌、弗氏志賀氏菌和施氏假單胞菌4種革蘭氏陰性菌，以探究抗菌肽SCY2與被測的3種抗生素的協(xié)同抗菌作用，為抗菌肽替代或部分替代抗生素的使用奠定理論基礎(chǔ)?？咕囼?yàn)結(jié)果表明，抗菌肽SCY2與四環(huán)素對熒光假單胞菌的抑殺具有協(xié)同作用，抗菌肽SCY2與青霉素對施氏假單胞菌的抑殺具有增強(qiáng)作用?？梢?，抗菌肽SCY2與抗生素協(xié)同使用時，在一定程度上可以減少使用抗生素的種類或降低抗生素的用量。較低濃度的抗生素與抗菌肽協(xié)同使用比單獨(dú)使用高濃度的抗生素抗菌效果更好，可有效地減少抗生素的使用，降低食品中抗生素的殘留風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn):

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