康萊特注射液對人NK細(xì)胞功能作用研究

★ 黃挺 李小英（1.杭州市中醫(yī)院 杭州 310007；.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，薏苡仁味甘淡，性涼，主入脾、胃、肺經(jīng)，具有健脾補(bǔ)肺、利水消腫、舒筋除痹、清熱排膿之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，薏苡仁中含有脂肪酸及脂、多糖類化合物、氨基酸等，具有抗腫瘤，增強(qiáng)機(jī)體免疫，降血糖，抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性［1］?？等R特注射液（Kanglaite Injection，KLT）是從薏苡仁中提取、研制而成的供靜、動脈直接輸注的脂肪乳劑，主要成份為薏苡仁油，具有益氣養(yǎng)陰、消癥散結(jié)的作用，臨床上常聯(lián)合放化療或分子靶向藥物用于治療肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］、結(jié)直腸癌［5］等惡性腫瘤，具有增敏減毒，改善患者生活質(zhì)量，延長生存期，提高機(jī)體免疫力的功效。

自然殺傷細(xì)胞（Nature killer cell，NK細(xì)胞）是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞，形成了人體抗腫瘤和抗病毒感染的第一道防線［6］，其殺傷靶細(xì)胞不需要預(yù)先致敏，且不受MHC限制，是一種安全有效的廣譜抗腫瘤細(xì)胞［7］?；罨腘K細(xì)胞能夠直接溶解主要組織相容性復(fù)合體I（MHC-I）分子缺陷的腫瘤細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶B或抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）直接殺傷腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞，還可分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）等一系列促炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)而殺傷腫瘤細(xì)胞［8-9］?？等R特注射液對人NK細(xì)胞的作用，國內(nèi)未見文獻(xiàn)報道。因此本實(shí)驗(yàn)利用中藥制劑康萊特注射液體外誘導(dǎo)培養(yǎng)人NK細(xì)胞，旨在探討康萊特注射液對人NK細(xì)胞增殖活力、免疫表型及殺傷活性的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 肺癌A549細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室RPMI1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10%FBS）培養(yǎng)；康萊特注射液購自浙江康萊特藥業(yè)有限公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技有限公司；rhIL-2購自北京四環(huán)生物制藥有限公司；人源化CD3單抗購自妙通（上海）生物科技有限公司；CCK-8溶液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶購自加拿大invitrogen公司；熒光標(biāo)記抗體PE-CD3、PE-Cy7-CD56均購自美國eBioscince公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）購自天津市灝洋生物制品科技有限公司；ELISA試劑盒（IFN-γ，TNF-α）購自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀Multiskan FC購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 NK細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增

1.2.1 外周抗凝血采集 選取健康志愿者及2016年3月—8月期間杭州市中醫(yī)院腫瘤科晚期肺癌（腺癌）患者各5例，分別采集肘靜脈血30mL，收集于含10mL肝素的抗凝瓶內(nèi)。

1.2.2 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離 預(yù)先將人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque（密度1.077），加入兩支50mL無菌離心管，10mL每管。用生理鹽水將吸取血漿后的標(biāo)本還原至40mL并充分混勻，緩慢加入在Ficoll-Hypaque上，分離液和血液樣本的體積比為1∶2，2000rpm離心20min，離心完畢，小心吸取白膜層的單個核細(xì)胞，加生理鹽水補(bǔ)足40mL，2000rpm離心10min，共洗滌3次。

1.2.3 NK細(xì)胞的培養(yǎng)及擴(kuò)增 將PBMC懸浮于NK細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)液+1000IU/mL rhIL-2+100IU/mL青-鏈霉素溶液），調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種至w/2mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加5%自體血漿、10ng/mL CD3單抗，混勻后放置在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此后每隔24h補(bǔ)加CD3單抗10ng/mL，連續(xù)添加4天。細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，離心收集細(xì)胞，棄上清，用生理鹽水洗滌1次，加入新鮮NK細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于6孔板中，根據(jù)添加不同濃度的康萊特注射液分為A-E 5組：A組（不加康萊特），B-E組（分別加康萊特0.25、0.5、1、2μL/mL），加入相應(yīng)濃度的康萊特注射液后混勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每隔2～3天，根據(jù)細(xì)胞生長情況半量換液，并補(bǔ)加新鮮NK細(xì)胞培養(yǎng)基、5%自體血漿和相應(yīng)濃度的康萊特注射液。若NK細(xì)胞擴(kuò)增狀況良好，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 NK細(xì)胞形態(tài)及增殖能力的分析 誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)的第7、10、15天，在倒置顯微鏡下觀察NK細(xì)胞的形態(tài)，并用0.4%臺盼藍(lán)進(jìn)行染色，通過全自動血細(xì)胞計數(shù)儀檢測各組NK細(xì)胞濃度，計算細(xì)胞總數(shù)（細(xì)胞總數(shù)=培養(yǎng)液總體積×細(xì)胞濃度）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組NK細(xì)胞免疫表型

1.4.1 流式細(xì)胞儀檢測體外擴(kuò)增產(chǎn)物的制備 于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的第15天，將各組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹勻后分別取2×105個細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌3次，吸取上清液，沉淀的細(xì)胞加入1mL生理鹽水重懸。

1.4.2 流式抗體的標(biāo)記 空白對照管中不加任何熒光抗體，向CD3單標(biāo)記管中加入5μl PE-CD3熒光抗體，CD56單標(biāo)記管中加入5μl PE-Cy7-CD56熒光抗體，向雙標(biāo)記管中同時加入5μl PE-CD3熒光抗體和5μl PE-Cy7-CD56熒光抗體，混合均勻，4℃避光靜置30min，1000rpm離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌細(xì)胞2遍，棄上清，沉淀的細(xì)胞加入500μL生理鹽水重懸并轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的BD管中，即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析CD3-CD56+細(xì)胞的百分比。

1.5 ELISA法檢測各組NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌量 收集各組體外培養(yǎng)至15天的NK細(xì)胞，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種于96孔板，每組設(shè)置3個平行復(fù)孔，放置在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育48h后取出，1500rpm離心5min，每孔吸取100μL細(xì)胞上清液，用ELISA法檢測各組NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌量。

1.6 CCK-8法檢測NK細(xì)胞的殺傷活性

1.6.1 肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的肺癌A549細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（100IU/mL青-鏈霉素溶液）的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，定期更換培養(yǎng)液，大概有80%～90%鋪滿培養(yǎng)瓶底則可進(jìn)行傳代。

1.6.2 靶細(xì)胞的制備 取對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞，吸走培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗細(xì)胞2次，加入37℃預(yù)熱的胰蛋白酶消化貼壁的A549細(xì)胞，待細(xì)胞完全脫落后，加入含10%FBS RPMI1640培養(yǎng)液終止消化，充分吹打細(xì)胞液，將其混勻，計數(shù)。收集細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL作為靶細(xì)胞。

1.6.3 效應(yīng)細(xì)胞的制備 在各組NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第15天，將每組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹勻后，計數(shù)。收集各組NK細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，將NK細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL作為效應(yīng)細(xì)胞。

1.6.4 CCK-8法檢測各組NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力 取平底96孔培養(yǎng)板，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，分為靶細(xì)胞組、效應(yīng)細(xì)胞組和實(shí)驗(yàn)組，按效靶比10∶1種入效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞。其中靶細(xì)胞組、實(shí)驗(yàn)組提前種入靶細(xì)胞，每孔50μL，96孔板最外周一圈每孔分別加入100μL生理鹽水，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后取出，在倒置顯微鏡下觀察每孔中靶細(xì)胞均已貼壁。吸走培養(yǎng)液，靶細(xì)胞組每孔加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)液100μL。效應(yīng)細(xì)胞組每孔加入效應(yīng)細(xì)胞、RPMI1640培養(yǎng)液各50μL，實(shí)驗(yàn)組每孔加入效應(yīng)細(xì)胞、RPMI1640培養(yǎng)液各50μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h。每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育1-2h，終止培養(yǎng)，全自動酶標(biāo)儀檢測各孔在450nm波長處的光密度（D）值，并計算殺傷率。NK細(xì)胞殺傷活性（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞孔OD值）/靶細(xì)胞孔0D值］×100%

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察NK細(xì)胞體積較小，圓形透亮，在培養(yǎng)基中呈懸浮生長。各組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第7天開始分裂增殖，細(xì)胞生長快，數(shù)量逐漸增多，各組間差異不明顯。細(xì)胞培養(yǎng)至第10天，A、B、C、D、E組均有細(xì)胞集落形成，但A組和B組細(xì)胞集落體積較小，集落數(shù)較少，而C、D、E組細(xì)胞集落體積較大，集落數(shù)較多，尤以D組最明顯（見圖1）。

2.2 培養(yǎng)第10天、第15天各組NK細(xì)胞增殖情況 患者樣本組中各組NK細(xì)胞增殖情況顯示（見表1），培養(yǎng)至第15天時，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)與不加KLT對照組比較均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），1μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)增加最明顯［（33.97±1.97）×106］。

圖1 培養(yǎng)第10天各組NK細(xì)胞鏡下形態(tài)（×400）

表1 患者樣本組各組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第10天和第15天的增殖情況（n=5，×106）

健康人樣本組中各組NK細(xì)胞培養(yǎng)至第15天時，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)均比不加KLT對照組顯著增加［（36.13±2.35）×106、（44.29±2.08）×106、（38.17±2.14）×106vs （30.32±1.76）×106，P＜0.05 或P＜0.01］。其中也以 1μL/mL KLT 組 NK細(xì)胞數(shù)增加最明顯。（見表2）。

表2 健康人樣本組各組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第10天和第15天的增殖情況（n=5，×106）

2.3 KLT對NK細(xì)胞免疫表型的影響 患者樣本組流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示，1、2μL/mL KLT組NK細(xì)胞中CD3－CD56+細(xì)胞比例較不加KLT對照組明顯升高［（44.74±11.36）%、（36.95±8.37）%vs （21.71±7.64）%，P＜0.01、P＜0.05］。（見表3）。

表3 培養(yǎng)第15天各組NK細(xì)胞CD3－CD56＋細(xì)胞比例（%）

健康人樣本組流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示，0.5～2μL/mL KLT組NK 細(xì)胞中 CD3－CD56+細(xì)胞比例顯著高于不加KLT對照組［（35.13±9.33）%、（46.56±10.78）%、（38.40±8.74）% vs（22.38±8.26）%，P＜0.05或P＜0.01］。（見表 3）。

2.4 各組 NK細(xì)胞IFN-γ、TNF-α分泌水平變化 患者樣本組與健康人樣本組ELISA法檢測結(jié)果均顯示，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α均高于不加KLT對照組（P＜0.05或P＜0.01），以 1μL/mL KLT組 NK 細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α最高，且與其他組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 培養(yǎng)第15天各組NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌水平（pg/mL）

2.5 CCK-8法檢測各組NK細(xì)胞殺傷活性結(jié)果 患者 樣 本 組 在 10∶1效 靶 比 時，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性分別為（53.34±5.42）%、（63.54±5.50）%、（56.55±4.32）%，均明顯高于不加KLT對照組［（41.81±5.66）%］（P＜0.01）。 可 見 1μL/mL KLT 組 NK 細(xì) 胞 殺 傷活性最強(qiáng)，與其他組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 4。

表4 培養(yǎng)第15天10∶1效靶比時各組NK細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷率（%）

健康人樣本組在10∶1效靶比時，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性比不加KLT對照組明顯升高［（54.15±5.86）%、（64.11±3.82）%、（56.91±5.21）% vs（42.39±5.91）%］（P＜0.01），并以1μL/mL KLT組NK細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)，與其他組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

NK細(xì)胞是天然殺傷細(xì)胞，其在發(fā)揮抗腫瘤活性，參與免疫應(yīng)答的過程中，會在免疫應(yīng)答的早期，通過分泌IFN-γ和TNF-α來實(shí)現(xiàn)其在固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁作用。體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞在殺傷靶細(xì)胞時，同樣也會分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其活化和殺傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，患者樣本組和健康人樣本組中，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α均明顯高于不加KLT對照組，并且這三組NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性也顯著高于對照組。其中1μL/mL KLT組NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α的量最多，對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性也最強(qiáng)，兩者結(jié)果相一致。表明康萊特注射液可以通過上調(diào)NK細(xì)胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平進(jìn)一步提高NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性。

PI3K/AKT通路廣泛存在于細(xì)胞中，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖和分化等多種功能，是最主要的抑制細(xì)胞凋亡的信號途徑。許琳等［10］在觀察漢黃芩素對NK細(xì)胞的作用研究中發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，上調(diào)NK細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)，由此認(rèn)為漢黃芩素促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用具有免疫調(diào)節(jié)功能的康萊特注射液加入到傳統(tǒng)NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時間的延長，患者樣本組和健康人樣本組中，各組NK細(xì)胞增殖均升高。細(xì)胞培養(yǎng)第15天，與對照組比較，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞的增殖均明顯升高，1μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)增加最明顯。表明康萊特注射液對NK細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用，這可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究表明，康萊特注射液可提高患者的細(xì)胞免疫功能，改善患者生存質(zhì)量。曹向明等［11］研究中發(fā)現(xiàn)康萊特注射液能激活NK細(xì)胞活性，使CD4＋、CD4＋/CD8＋比例上升，促進(jìn)IL-2分泌，激活巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而提高機(jī)體免疫力。本實(shí)驗(yàn)中，各組NK細(xì)胞培養(yǎng)第15天，患者樣本組檢測結(jié)果示，與對照組比較，1～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞中CD3－CD56＋細(xì)胞比例明顯升高。健康人樣本組結(jié)果顯示，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞中CD3－CD56＋細(xì)胞比例明顯高于對照組。表明康萊特注射液能夠提高NK細(xì)胞中CD3－CD56＋細(xì)胞比例。

綜上，康萊特注射液在體外實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，增加NK細(xì)胞CD3-CD56+細(xì)胞比例，并通過分泌更多的IFN-γ、TNF-α來提高對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性，以上結(jié)論可為康萊特注射液聯(lián)合NK細(xì)胞治療惡性腫瘤提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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