HPLC法測定創(chuàng)愈寧凝膠劑中5種大黃蒽醌類成分

★ 肖飛 彭紅 張婷 金鑫（江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004）

創(chuàng)愈寧凝膠劑是由大黃提取物加卡波姆940、丙二醇、薄荷醇、三乙醇胺等適宜輔料制成的親水性凝膠劑，屬于中藥外用制劑，主要用于治療燒燙傷。

大黃作為歷代醫(yī)家本草和歷版《中國藥典》所收載的常用中藥，來源于蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖［1］，性味苦寒，歸脾、胃、大腸、心、肝經(jīng)，主要分布于陜西、四川、甘肅、青海等［2］。其化學成分主要有蒽醌類、蒽酮類、萘衍生物類、鞣質(zhì)類等［3］。具有瀉下、降血脂、抗感染、改善腎功能等藥理作用［4］，其游離蒽醌類成分亦具有抑菌抗炎等多種藥理活性［5］。

大黃提取物作為創(chuàng)愈寧凝膠劑中主要有效成分，本研究首次通過對其有效成分中的5種大黃游離蒽醌的同時測定，初步確定高效液相法為其質(zhì)量監(jiān)測有效方法，為保障其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫1200高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器），電子天平（北京賽多利斯電子儀器有限公司），GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司），SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海雅榮生化儀器設備有限公司）。

創(chuàng)愈寧凝膠劑樣品由江西悅耳醫(yī)藥有限公司提供，五批樣品批號分別為20140520、20140522、20140524、20140601、20140606、20140610； 蘆薈大黃素（上海科順生物科技有限公司，純度為98.5%）、大黃酸（上海撫生實業(yè)有限公司，純度為98%）、大黃素（南京森貝伽生物科技有限公司，純度為98%）、大黃酚（上海研生實業(yè)有限公司，純度為98%）、大黃素甲醚對照品（上海研生實業(yè)有限公司，純度為98%）；磷酸（色譜純），甲醇（色譜純），自制三蒸水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品約10mg、5mg、10mg、20mg、10mg，置 于 50mL容 量 瓶中，加甲醇適量，再超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，冷卻至室溫，用甲醇定容成質(zhì)量濃度分別為 0.2001、0.1001、0.2002、0.4001、0.2002mg/mL的儲備液。精密量取上述5種對照品儲備液各2mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度即得。

2.1.2 供試品溶液 精密稱定本品約2g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，再超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，冷卻至室溫，稱定重量，再用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，后取續(xù)濾液即得。

2.2 色譜條件 色譜柱為InertSutain C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15）；流速為1.0mL/min；檢測波長為254nm；柱溫為25℃；進樣量為20μL。

2.3 專屬性 精密吸取混合對照品、供試品溶液注入高效液相色譜儀測定。結(jié)果顯示供試品溶液中5種大黃游離蒽醌成分得到很好的分離。見圖1。

圖1 混合對照品（A）和凝膠劑溶液（B）的色譜圖

2.4 線性試驗 精密移取對照品儲備液各0.5、1、2、3、4mL，置10mL容量瓶，用流動相定容至刻度。注入液相色譜儀分析。以色譜峰峰面積A縱坐標，濃度為橫坐標進行回歸分析。回歸方程如下：蘆薈大黃素Y=85.73X-23.51，r=0.9999；大黃酸Y=70.046X-4.1506，r=0.9999； 大 黃 素 Y=58.161X-1.8159，r=0.9999；大黃酚Y=83.624X-12.027，r=0.9999；大黃素甲醚Y=17.816X＋8.5988，r=0.9999。結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別在10.01～80.08、5.005～40.04、10.01～80.08、20.00～160.0、10.00～80.04μg/mL與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度和穩(wěn)定性試驗 精密量取同一混合對照品溶液，重復進樣6次，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積，計算RSD分別為：0.68%、0.76%、0.39%、0.86%、0.93%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

取同一份供試品（樣品批號：20140522）溶液分別于0、2、4、8、12h進行測定，記錄峰面積，計算RSD分別為0.46%、1.10%、0.89%、0.96%、0.93%，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗 取同一批號樣品（批號：20140520），按照2.1.2項下的方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測定。計算6份供試品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為0.81、0.46、1.30、2.43、1.59mg/g，RSD分別為1.10%、0.96%、0.88%、0.59%、1.20%。說明含量測定方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 取已知含量的創(chuàng)愈寧凝膠劑樣品（批號：20140522）6份，每份約1.0g，精密稱定，分別精密加入蘆薈大黃素、大黃酸對照品儲備液各4mL，大黃素、大黃酚對照品儲備液各6mL，大黃素甲醚對照品儲備液8mL，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定。計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.8 含量測定 取5批樣品，按照2.1.2項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，每批樣品平行測定三次，含量測定結(jié)果見表2。

表2 創(chuàng)愈寧凝膠劑中游離蒽醌成分含量測定結(jié)果 mg/g

3 討論

本試驗，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚溶液濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，5種蒽醌類成分分離度高，峰形好。

凝膠劑是近年發(fā)展起來的一種新劑型，按其基質(zhì)類型可分為親水性凝膠、親脂性凝膠和乳劑型凝膠［6］，本研究的創(chuàng)愈寧凝膠劑屬于親水性凝膠劑。大黃游離蒽醌類成分是該凝膠劑的藥效成分，因此，綜合考察蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量可更好的控制該制劑的質(zhì)量。

實驗結(jié)果顯示，HPLC法同時測定創(chuàng)愈寧凝膠劑中5種大黃游離蒽醌類成分的方法簡便、準確可靠、靈敏度高、重復性好等特點，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:23．

［2］王巖, 宋良科, 王小寧,等. 大黃種質(zhì)考證與資源分布[J]. 中國藥房,2013, 24(11):1 040-1 043.

［3］梁淋淵, 甘麥鄰, 羅燕. 大黃化學成分與藥理活性研究進展[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2017, 36(1):80-83.

［4］黃娟, 張慶蓮, 皮鳳娟,等. 大黃的藥理作用研究進展[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析, 2014, 14(3):282-284.

［5］張丹丹. 大黃的臨床藥理研究[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育, 2011,9(17):68-69.

［6］王曙東, 劉文雅. 凝膠劑的研究進展及應用概況[J]. 中國藥業(yè),2010, 19(21):1-4.