SIRT1的表達在食管鱗狀細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的臨床意義

孔德華，曾薇，朱金峰，單莉△

食管癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，位居全球腫瘤引發(fā)死亡的第6位［1］。我國更是食管癌大國，且以鱗癌為主［2］。隨著外科技術(shù)的提高以及新輔助放化療、靶向治療的運用，食管癌患者的預后有了一定程度的改善，但患者的5年總體生存率仍較低，為15%～25%。究其原因，與術(shù)后腫瘤的侵襲及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-5］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是指癌細胞從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到遠處部位并在遠處部位形成腫瘤的過程［6-7］。侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特征之一［1，8］，腫瘤只有具備侵襲轉(zhuǎn)移的能力，才能脫離原發(fā)灶，向臨近組織及其他適宜生長的環(huán)境侵襲。研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［9-10］。SIRT1屬于煙酰胺（NAD+）依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；竤irtuin家族成員，其主要作用不僅能去乙?；凹谆揎椊M蛋白，還能與多種非組蛋白相互作用，參與多種病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在腫瘤中的作用具有雙面性，既可抑制腫瘤，也可促進腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移［11］。目前有關(guān)SIRT1與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及其對預后的研究較少。本研究采用免疫組化方法檢測食管鱗癌組織及正常食管組織中SIRT1的表達情況，分析其與臨床病理特征及預后的相關(guān)性，探討SIRT1與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—12月于新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院行根治性手術(shù)的食管鱗癌患者104例，其中男79例，女25例；年齡36～80歲，中位年齡61歲；胸上段食管癌21例、胸中段食管癌71例、胸下段食管癌12例；腫瘤組織學分級、術(shù)后TNM分期均采用第7版美國癌癥聯(lián)盟（AJCC）標準［12］：高分化17例、中分化69例和低分化18例；Ⅰ～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期38例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理證實為食管鱗狀細胞癌，且術(shù)前未接受放化療、靶向、生物治療等與腫瘤相關(guān)治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 免疫組化法檢測食管鱗癌組織及正常組織中SIRT1的表達 取患者石蠟組織標本，包含癌組織和距腫瘤組織5 cm以外的癌旁正常組織。所有病理石蠟塊標本采用全自動石蠟切片機切片，制成4μm厚的病理切片。采用免疫組化EnVision法對SIRT1染色。兔抗人SIRT1多克隆IgG抗體（13161-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔二步法試劑盒（pv-6001）、DAB二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化染色嚴格按試劑盒說明書操作。

免疫組化結(jié)果判讀：切片染色后均由我院病理科兩名副主任醫(yī)師各自獨立閱片，SIRT1蛋白主要位于胞質(zhì)與胞核中，當出現(xiàn)淺黃色至深黃色顆粒樣物質(zhì)為陽性細胞。采用陽性細胞計數(shù)與染色強度相結(jié)合的二級計分法進行評分［13］。著色強度為0級（無著色/-）計0分，1級（黃色/+）計1分，2級（棕黃色/++）計2分，3級（棕褐色/+++）計3分。陽性細胞百分比≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。總分由陽性細胞百分比及著色強度兩項計分相乘所得，總分＜4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.3 SIRT1表達與食管癌患者臨床病理特征及預后的關(guān)系 分析不同臨床病理特征食管癌患者SIRT1的表達差異。將臨床資料及SIRT1表達情況進行分組納入生存分析，以確定影響食管癌患者預后的影響因素。總生存時間（OS）定義為研究對象起始事件與終點事件的時間間隔。中位生存時間定義為生存率為50%時對應的生存時間。起始事件定義為患者手術(shù)標本經(jīng)病理證實為食管鱗癌。定義終點事件為患者死亡。

1.4 隨訪 主要采用定期住院復查、門診及電話隨訪。住院復查及門診隨訪術(shù)后第1年內(nèi)每3個月1次，以后每6個月1次，如出現(xiàn)不適隨時就診。隨訪截止時間為2015年12月31日，隨訪時間3～80個月，中位隨訪時間30.5個月，失訪12例，隨訪完成率88.46%。失訪者隨訪時間按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。SIRT1與各項臨床病理學特征間的關(guān)系采用χ2檢驗。應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并應用Log-rank檢驗各亞組中的生存率差異。采用Cox回歸模型進行多因素預后分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在食管鱗癌與癌旁組織中的表達情況 SIRT1蛋白在食管鱗癌組織中主要定位于胞核與胞質(zhì)中，其在正常組織主要位于胞核、部分胞質(zhì)中。免疫組化染色的陽性信號呈淺黃色至深黃色顆粒樣物質(zhì)，見圖1。SIRT1在食管鱗癌組織與癌旁組織中的陽性表達率分別為61.54%（64/104）、29.81%（31/104），癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=21.100，P＜0.05）。

2.2 SIRT1的表達與臨床病理特征間的關(guān)系 104例食管癌組織中，SIRT1的表達與脈管浸潤（VI）、浸潤深度（pT）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（pN）、腫瘤臨床分期（pTNM）密切相關(guān)（均P＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤位置、組織類型、神經(jīng)侵犯無相關(guān)性，見表1。

Fig.1 Expression of SIRT1 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous tissues(IHC,×200)圖1 食管鱗癌及癌旁組織SIRT1的表達（IHC，×200）

Tab.1 Relationship between expression of SIRT1 and clinicopathological features表1 SIRT1的表達與臨床病理特征間的關(guān)系 例（%）

2.3 SIRT1表達與食管癌患者預后的關(guān)系 104例食管癌患者的5年生存率為40.30%，中位生存時間為35個月，見圖2A。SIRT1陽性表達者和陰性表達者的5年生存率分別為28.70%和59.10%，SIRT1陽性表達者的總體生存率較陰性表達者低，差異有統(tǒng)計學意義（Log-rankχ2=10.065，P＜0.05），見圖2B。單因素分析結(jié)果顯示，與食管鱗癌預后可能有關(guān)的因素包括脈管浸潤、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期以及SIRT1表達情況，見表2。以脈管浸潤（無=0，有=1）、浸潤深度（T1～T2=0，T3～T4=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陰性=0，陽性=1）、臨床分期（Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1）、SIRT1 表達（陰性=0，陽性=1）為自變量，以預后（生存=0，死亡=1）為因變量，進行Cox多因素回歸分析。結(jié)果顯示，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期以及SIRT1表達是食管鱗癌預后的獨立影響因素，見表3。

Fig.2 Expression of SIRT1 in esophageal squamous cell carcinoma and survival prognosis of patients圖2 食管鱗癌組織中SIRT1的表達與患者的生存預后

3 討論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移在腫瘤的進展中扮演著極為重要的角色，一旦腫瘤出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，則提示患者預后較差，因此對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移途徑的干預，有利于控制腫瘤進展，使患者獲得更好的預后。SIRT1是sirtuin家族中研究最多的成員之一，其在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中存在兩面性，其原因可能與組織不同有關(guān)。有研究顯示，SIRT1可抑制腫瘤生長，其機制之一是通過去乙酰化缺氧誘導因子-1α（HIF-1α），并使其失活，抑制乏氧腫瘤細胞的增殖、血管生成與能量代謝及降低腫瘤組織淋巴管轉(zhuǎn)移，以此達到抗腫瘤目的［14-15］。但是 Zhu 等［16］的研究表明，SIRT1與腫瘤細胞生長，侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，當采用SIRT1抑制劑使其沉默后，可導致腫瘤細胞凋亡增多，細胞侵襲能力受到抑制。本研究結(jié)果顯示，在食管鱗癌組織中SIRT1蛋白的表達顯著高于正常食管組織，這與 He 等［17］對食管癌、齊曉瑩等［18］對直腸癌以及張靜等［19］對胃癌的研究結(jié)果一致，提示SIRT1可促進多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究結(jié)果顯示，SIRT1在食管鱗癌組織中高表達與腫瘤的脈管浸潤、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期密切相關(guān)，與劉麗英等［20］的研究結(jié)果基本一致，提示SIRT1蛋白在食管鱗癌中可促進腫瘤的進展，靶向抑制SIRT1的表達可能抑制食管癌細胞的增殖。但與He等［17］的研究結(jié)論卻存在差異，可能原因為He等的研究樣本量較少，浸潤深度組內(nèi)樣本分布不均所致。Lin等［21］在肺癌腦轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)SIRT1在合并腦轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌（NSCLC）中較無腦轉(zhuǎn)移的NSCLC中表達升高，進一步提示SIRT1可導致腫瘤向遠處侵襲轉(zhuǎn)移，其也可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在標志物之一。需要指出的是，上述研究均未提及SIRT1與腫瘤脈管浸潤間的關(guān)系，本研究雖提示脈管浸潤與SIRT1的表達存在關(guān)聯(lián)，但因本研究樣本量有限，結(jié)論有待進一步驗證。

Tab.2 Univariate analysis of prognosis factors in 104 patients with esophageal squamous cell carcinoma表2 104例食管癌患者生存資料的單因素分析

Tab.3 Multivariate analysis of prognosis factors in 104 patients with esophageal squamous cell carcinoma表3 104例食管癌患者生存資料的多因素分析

另外，SIRT1 在乳腺癌［22］、胃癌［23］、結(jié)直腸癌［24］、前列腺癌［25］、肺癌［26］中均呈過表達狀態(tài)，該類腫瘤患者的臨床預后較差，且SIRT1的表達水平與預后呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SIRT1在食管鱗癌中高表達與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。SIRT1的表達、VI、pT、pN與pTNM是食管鱗癌患者預后的獨立影響因素，且腫瘤浸潤深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期晚、SIRT1高表達的患者預后更差，這與Chen等［27］的研究結(jié)果基本一致。但與Chen等［27］的研究結(jié)果不同的是，本研究中腫瘤的組織學類型不是食管鱗癌預后的影響因素，可能原因為本實驗樣本量較少，組織學類型中各組病例數(shù)分布不均衡（高分化組與低分化組的例數(shù)較少）等因素造成的，有待后續(xù)研究驗證。

［1］Pennathur A，Gibson MK，Jobe BA，et al.Oesophageal carcinoma［J］.Lancet，2013，381（9864）：400-412.doi：10.1016/S0140-6736（12）60643-6.

［2］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.doi：10.3322/caac.21262.

［3］Akutsu Y，Matsubara H，Shuto K，et al.Clinical and pathologic evaluation of the effectiveness of neoadjuvant chemoradiation therapy in advanced esophageal cancer patients［J］.World J Surg，2009，33（5）：1002-1009.doi：10.1007/s00268-008-9899-8.

［4］Talsma K，Van HP，Grotenhuis BA，et al.Comparison of the 6th and 7th editions of the UICC-AJCC TNM classification for esophageal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2012，19（7）：2142-2148.doi：10.1245/s10434-012-2218-5.

［5］Chen H，Zhou W，Zhe Y，et al.Prospective study of adjuvant radiotherapy on preventing lymph node metastasis after ivor-lewis esophagectomy in esophageal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2013，20（8）：2721-2726.doi：10.1245/s10434-013-2928-3.

［6］Fidler IJ.The pathogenesis of cancer metastasis：the‘seed and soil’hypothesis revisited［J］.Nat Rev Cancer，2003，3（6）：453-458.doi：10.1038/nrc1098.

［7］Steeg PS.Tumor metastasis：mechanistic insights and clinical challenges［J］.Nat Med，2006，6（8）：895.doi：10.1038/nm1469.

［8］Savage N.Metastasis：Resistance fighters［J］.Nature，2015，528（7582）：S128.doi：10.1038/528S128a.

［9］Tang BL.Sirt1 and cell migration［J］.Cell Adh Migr，2010，4（2）：163-165.

［10］Byles V，Zhu L，Lovaas JD，et al.SIRT1 induces EMT by cooperating with EMT transcription factors and enhances prostate cancer cell migration and metastasis［J］.Oncogene，2012，31（43）：4619-4629.doi：10.1038/onc.2011.612.

［11］Song NY，Surh YJ.Janus-faced role of SIRT1 in tumorigenesis［J］.Ann N Y Acad Sci，2012，1271（1）：10-19.doi：10.1111/j.1749-6632.2012.06762.

［12］Rice TW，Blackstone EH，Rusch VW.7th Edition of the AJCC Cancer Staging Manual：Esophagus and Esophagogastric Junction［J］.Ann Surg Oncol，2010，17（7）：1721-1724.doi：10.1245/s10434-010-1024-1.

［13］Huffman DM，Grizzle WE，Bamman MM，et al.SIRT1 is significantly elevated in mouse and human prostate cancer［J］.Cancer Res，2007，67（14）：6612-6618.doi：10.1158/0008-5472.CAN-07-0085.

［14］Lim JH，Lee YM，Chun YS，et al.Sirtuin 1 modulates cellular responses to hypoxia by deacetylating hypoxia-inducible factor 1α［J］.Molecular Cell，2010，38（6）：864-878.doi：10.1016/j.molcel.2010.05.023.

［15］Zampell JC，Yan A，Avraham T，et al.HIF-1α coordinates lymphangiogenesis during wound healing and in response to inflammation［J］.FASEB J，2012，26（3）：1027-1039.doi：10.1096/fj.11-195321.

［16］Zhu L，QiJ，ChiaoCY，etal.Identification ofanovel polyprenylated acylphloroglucinol-derived SIRT1 inhibitor with cancer-specific anti-proliferative and invasion-suppressing activities［J］.Int J Oncol，2014，45（5）：2128-2136.doi：10.3892/ijo.2014.2639.

［17］He Z，Yi J，Jin L，et al.Overexpression of Sirtuin-1 is associated with poor clinical outcome in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Tumour Biol，2016，37（6）：1-10.doi：10.1007/s13277-015-4459-y.

［18］齊曉瑩，蔣中秀，劉洋，等.沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1在直腸癌中的表達及臨床意義［J］.中國醫(yī)科大學學報，2015，44（7）：606-609.Qi XY，Jiang ZX，Liu Y，et al.Expression and clinical significance of Sir2-related enzymes-1 in colorectal cancer［J］.J Chin Med Univ，2015，44（7）：606-609.doi：10.3969/j.issn.0258-4646.2015.07.008.

［19］張靜，馮穎，王芳，等.胃癌組織中SIRT1、Noxa的表達及其臨床意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2016，32（9）：1019-1023.Zhang J，F(xiàn)eng Y，Wang F，et al.SIRT1 and Noxa expression in gastric cancer and its clinical significance［J］.Chin J Clin Exp Pathol，2016，32（9）：1019-1023.doi：10.13315/j.cnki.cjcep.2016.09.013.

［20］劉麗英，王尚凱，李宗明，等.食管鱗癌中信息調(diào)節(jié)因子1及Yes相關(guān)蛋白2蛋白表達的相關(guān)性及臨床意義［J］.中華實驗外科雜志，2016，33（9）：2220-2222.Liu LY，Wang SK，Li ZM，et al.The expression of silent information regulator 1 and Yes-associated protein 2 protein in esophageal squamous cell carcinoma and its correlation with clinicpathological significance［J］.Chin J Exp Surg，2016，33（9）：2220-2222.doi：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2016.09.048.

［21］Lin H，Xiao HL，Li XC，et al.SIRT1 is highly expressed in brain metastasis tissues of non-small cell lung cancer（NSCLC）and in positive regulation of NSCLC cell migration［J］.Int J Clin Exp Pathol，2013，6（11）：2357-2365.

［22］Cao YW，Li YC，Wan GX，et al.Clinicopathological and prognostic role of SIRT1 in breast cancer patients：a meta-analysis［J］.Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：616-624.

［23］趙偉，陳銳，劉芮菡，等.沉默信息調(diào)節(jié)因子1對胃癌侵襲的影響及其機理研究［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2014，4（21）：425-431.Zhao W，Chen R，Liu RH，et al.Effect and mechanism of Sirtuin 1 in invasion of gastric cancer［J］.Chin J Bas Clin Gen Surg，2014，4（21）：425-431.doi：10.7507/1007-9424.2014.01.04.

［24］Zu G，Ji A，Zhou T，et al.Clinicopathological significance of SIRT1 expression in colorectal cancer：A systematic review and meta analysis［J］.Int J Surg，2016，26：32-37.doi：10.1016/j.ijsu.2016.01.002.

［25］Duan K，Ge YC，Zhang XP，et al.MiR-34a inhibits cell proliferation in prostate cancer by downregulation of SIRT1 expression［J］.Oncol Lett，2015，10（5）：3223-3227.doi：10.3892/ol.2015.3645.

［26］Sang JN，Baek HA，Park HS，et al.Expression of SIRT1 and cortactin is associated with progression of non-small cell lung cancer［J］.Pathol Res Pract，2013，209（6）：365-370.doi：10.1016/j.prp.2013.03.011.

［27］Chen GQ，Tian H，Yue WM，et al.SIRT1 expression is associated with lymphangiogenesis，lymphovascular invasion and prognosis in pN0 esophageal squamous cell carcinoma［J］.Cell Biosci，2014，4（1）：48.doi：10.1186/2045-3701-4-48.