不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化及傷后認(rèn)知能力的研究

王計(jì)偉，王毅，王東，周源，陳芳蓮，崔維韻，劉麗，張建寧△

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科的常見疾病，患者預(yù)后差，致殘、致死率較高，給社會(huì)和患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。目前尚缺乏有效促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的方法，而近年來大量研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）可維持血管穩(wěn)態(tài)，并在顱腦創(chuàng)傷后歸巢、黏附、遷移到損傷部位并增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)血腦屏障，改善預(yù)后［2-3］。本研究通過對(duì)不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠循環(huán)血中的EPCs的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，并研究其與認(rèn)知功能改變的關(guān)系，旨在為后期研究TBI后EPCs參與血管神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 Model01-B型顱腦創(chuàng)傷儀（美國(guó)NEW SUN公司），TKR200C型小動(dòng)物呼吸機(jī)（江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司），臺(tái)式牙鉆（上海齒科醫(yī)械廠），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），K1800型小動(dòng)物血細(xì)胞檢測(cè)儀（日本Sysmex公司），Morris水迷宮系統(tǒng)及分析軟件（荷蘭NOLDUS公司），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司），大鼠淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司），小鼠單克隆抗體PE-CD34和小鼠單克隆抗體CD133（美國(guó)Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠單克隆抗體IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶科技有限公司），10%水合氯醛、增強(qiáng)型磷酸鋅水門汀等試劑由天津市神經(jīng)病學(xué)研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量（275±10）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2014-0004。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均置于室溫、避免異常環(huán)境刺激干擾、晝夜交替（12 h/12 h）條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)組、輕度TBI組、中度TBI組、重度TBI組，每組7只。

1.3 大鼠TBI模型制備 參照第3版大鼠腦立體定位圖譜［4］，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，注射劑量為300 mg/kg。待麻醉滿意后，常規(guī)備皮，安爾碘消毒頂部正中切口部位，分離皮下暴露頂骨。選擇前囟后4 mm，矢狀縫右側(cè)旁開3 mm處（大腦海馬區(qū)域）用齒科磨鉆鉆孔開圓形骨窗，骨窗直徑為4 mm，操作過程輕柔，保持完整的硬腦膜。用增強(qiáng)型磷酸鋅水門汀將顱骨連接管固定在圓形骨窗邊緣，待連接牢固后向管腔注入無菌生理鹽水排空氣泡，連接封閉液壓顱腦創(chuàng)傷儀。待大鼠恢復(fù)角膜反射及夾尾反射后進(jìn)行液壓打擊。打擊后立即將大鼠置于電熱恒溫墊上進(jìn)行搶救，小動(dòng)物呼吸機(jī)面罩吸氧，必要時(shí)給予胸廓擠壓，縫合頭皮。待大鼠生命體征平穩(wěn)后置回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅開骨窗，不進(jìn)行液壓打擊；輕、中、重度TBI組的液壓打擊力度分別為0.9、2.1 和 3.2 atm（1 atm=101.325 kPa）。

1.4 靜脈血標(biāo)本采集和處理 4組大鼠分別在創(chuàng)傷前（0 h）及創(chuàng)傷后 3、6、24、48、72、168、240、336 h 用直徑 1 mm 的無菌硬質(zhì)玻璃毛細(xì)采血管取大鼠內(nèi)眥球后靜脈叢血0.7 mL，置于EDTA抗凝管。其中0.6 mL參照文獻(xiàn)［2］的方法，采用密度梯度離心法提取含有EPCs的單個(gè)核細(xì)胞，余0.1 mL進(jìn)行白細(xì)胞（WBC）和血小板（PLT）計(jì)數(shù)。

1.5 EPCs的流式測(cè)定 將10μL小鼠單克隆抗體CD133與2μL FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠單克隆抗體混勻、震蕩，避光孵育2 h，制備FITC標(biāo)記的CD133。用0.5%BSA緩沖液將單個(gè)核細(xì)胞稀釋混勻至100μL，加入PE-CD34和FITCCD133各10μL充分混勻后低速震蕩，室溫避光孵育10 min。加0.5%BSA緩沖液2 mL混勻后以1 500 r/min離心10 min以去除未結(jié)合的二抗工作液，用0.5%BSA緩沖液重懸單個(gè)核細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。首先在前向角散射/側(cè)向角散射圖中選擇單個(gè)核細(xì)胞群體，排除細(xì)胞碎片和血小板的影響，然后檢測(cè)CD133+和CD34+雙陽性的細(xì)胞數(shù)量，即為EPCs數(shù)量。每個(gè)標(biāo)本均計(jì)數(shù)200 000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，后續(xù)流式數(shù)據(jù)分析采用FlowJo軟件。

1.6 水迷宮檢測(cè)認(rèn)知能力 參照Vorhees等［5］的報(bào)道，各組大鼠在TBI后第21～25天開始利用Morris水迷宮的方法檢測(cè)其認(rèn)知能力，在正式檢測(cè)前1 d，將大鼠置于水槽內(nèi)自由游泳2 min適應(yīng)環(huán)境。定位巡航實(shí)驗(yàn)：將大鼠按隨機(jī)順序從4個(gè)不同象限投放入水，記錄從象限出發(fā)點(diǎn)至尋找到并登上平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。空間探索實(shí)驗(yàn)：定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，去除水下平臺(tái)，將大鼠置于距離平臺(tái)最遠(yuǎn)的象限自由游泳60 s，記錄其在平臺(tái)所在象限停留的次數(shù)，計(jì)算目標(biāo)象限百分率（平臺(tái)所在象限停留的次數(shù)/所有象限停留的次數(shù)×100%）。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Morris水迷宮分析軟件計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析及單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血EPCs數(shù)量變化 假手術(shù)組循環(huán)血中EPCs數(shù)量在傷后3 h出現(xiàn)相應(yīng)升高，24 h后恢復(fù)至正常水平并保持穩(wěn)定，而各顱腦創(chuàng)傷組大鼠在傷后3 h開始循環(huán)血中EPCs數(shù)量下降至最低值，并在傷后6 h升高，在傷后48 h開始恢復(fù)至正常水平，從TBI后24 h開始，各組間EPCs數(shù)量變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。在傷后3 h，輕、中、重度顱腦創(chuàng)傷大鼠循環(huán)血中EPCs數(shù)量明顯少于假手術(shù)組，在傷后6 h，輕、中度顱腦創(chuàng)傷組EPCs數(shù)量則明顯高于假手術(shù)組，見表1。

2.2 外周血WBC、PLT水平變化 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各組WBC、PLT的變化并不一致。假手術(shù)組和輕度TBI組傷后3 h外周血WBC出現(xiàn)升高；中度TBI組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中WBC變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；重度TBI組在TBI后72 h內(nèi)WBC變化并不明顯，傷后168 h開始出現(xiàn)下降。見表2。各組PLT則是在TBI后期出現(xiàn)了升高，見表3。

Tab.1 Changes of endothelial progenitor cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats圖1 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠的EPCs隨時(shí)間的計(jì)數(shù)變化 （n=7，個(gè)/20萬單個(gè)核細(xì)胞，±s）

Tab.1 Changes of endothelial progenitor cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats圖1 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠的EPCs隨時(shí)間的計(jì)數(shù)變化 （n=7，個(gè)/20萬單個(gè)核細(xì)胞，±s）

＊＊P＜0.01；F 時(shí)間=50.664＊＊，F(xiàn) 組間=0.533，F(xiàn) 交互=11.880＊＊；組間比較：A與假手術(shù)組比較，B與輕度 TBI組比較，P＜0.05；組內(nèi)不同時(shí)間比較：a與0 h比較，b與TBI后3 h比較，c與TBI后6 h比較，P＜0.05

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Tab.2 Changes of white blood cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表2 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間的計(jì)數(shù)變化 （n=7，×109/L，±s）

Tab.2 Changes of white blood cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表2 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間的計(jì)數(shù)變化 （n=7，×109/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 時(shí)間=14.040，F(xiàn) 組間=3.977，F(xiàn) 交互=2.528，均 P＜0.05；組間比較：A與假手術(shù)組比較，B與輕度 TBI組比較，P＜0.05；組內(nèi)不同時(shí)間比較：a與0 h比較，b與TBI后3 h比較，c與TBI后6 h比較，P＜0.05

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Tab.3 Changes of platelets over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表3 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠血小板計(jì)數(shù)隨時(shí)間的計(jì)數(shù)變化 （n=7，×109/L，±s）

Tab.3 Changes of platelets over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表3 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠血小板計(jì)數(shù)隨時(shí)間的計(jì)數(shù)變化 （n=7，×109/L，±s）

＊＊P＜0.01；F 時(shí)間=23.368＊＊，F(xiàn) 組間=1.244，F(xiàn) 交互=2.635＊＊；組間比較：A與假手術(shù)組比較，B與輕度 TBI組比較，P＜0.05；組內(nèi)不同時(shí)間比較：a與0 h比較，b與TBI后3 h比較，c與TBI后6 h比較，P＜0.05

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2.3 大鼠認(rèn)知能力變化 各組大鼠逃避潛伏期隨著創(chuàng)傷時(shí)間的延長(zhǎng)而縮短，見圖1A；同期各TBI組逃避潛伏期均較假手術(shù)組延長(zhǎng)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組目標(biāo)象限百分率為50.2%±12.8%，而輕、中、重TBI組的目標(biāo)象限百分率分別為46.1%±10.2%、33.4%±9.1%、25.1±6.9%，中、重度 TBI組大鼠停留在目標(biāo)象限百分率低于假手術(shù)組和輕度TBI組，見圖1B。

Fig.1 Cognitive abilities of different degrees of traumatic brain injury in rats圖1 不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠的認(rèn)知能力檢測(cè)

3 討論

TBI致殘致死率高、預(yù)后差，是45歲以下青壯年死亡的主要原因，傷后常伴意識(shí)水平及內(nèi)容減退等高級(jí)神經(jīng)功能障礙［1］。由于原發(fā)性顱腦創(chuàng)傷干預(yù)困難，故目前的治療措施主要關(guān)注在TBI后血腦屏障破壞、血管神經(jīng)損傷、異常炎癥反應(yīng)等繼發(fā)性顱腦損傷的防治。Asahara等［6］在1997年首次從人循環(huán)血中成功分離到EPCs，并確認(rèn)其為參與血管生成的未分化細(xì)胞，可增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，雖然數(shù)量少，但具有較大的組織修復(fù)意義。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，EPCs在糖尿?。?］、心血管疾病［8］、自身免疫性疾?。?］、腦卒中［10］等多種疾病中具有潛在的治療價(jià)值。而本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，通過提高顱腦創(chuàng)傷大鼠循環(huán)血中的EPCs數(shù)量，可以促進(jìn)血管新生，修復(fù)血腦屏障，改善預(yù)后［3，11］。因此 EPCs的研究有望改善TBI后的神經(jīng)血管修復(fù)，為TBI的治療提供了新的思路，有必要對(duì)EPCs進(jìn)行更加深入的基礎(chǔ)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，顱腦創(chuàng)傷后，循環(huán)血中EPCs數(shù)量在傷后3 h開始下降至最低值，并在傷后6 h升高，在傷后48 h始恢復(fù)至正常水平，此先低后高的變化趨勢(shì)與之前的研究結(jié)果一致［12］。結(jié)合前期研究成果，筆者推測(cè)EPCs的動(dòng)態(tài)變化的原因可能是由于循環(huán)血EPCs向創(chuàng)傷灶歸巢消耗導(dǎo)致其數(shù)量降低，后動(dòng)員骨髓EPCs入血使其升高；腦創(chuàng)傷急性期的應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致內(nèi)分泌軸紊亂，抑制早期的EPCs動(dòng)員。由于血小板與血管新生關(guān)系密切，且EPCs取自單個(gè)核細(xì)胞，故筆者也研究了EPCs與上述兩者之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中EPCs的變化與WBC和PLT并不一致。Guo等［13］最新的研究證實(shí)，靜脈輸注體外培養(yǎng)的EPCs可選擇性地歸巢到顱腦損傷部位，而不歸巢至正常腦組織，通過修復(fù)血管功能繼而起到神經(jīng)再生、保護(hù)神經(jīng)功能的作用。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)大鼠顱腦創(chuàng)傷后EPCs的數(shù)量變化與其認(rèn)知能力密切相關(guān)：輕度TBI組大鼠EPCs數(shù)量在傷后6 h與假手術(shù)組相比明顯升高，而此時(shí)重度TBI組EPCs數(shù)量仍低于假手術(shù)組。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕度TBI組逃避潛伏期和目標(biāo)象限百分率明顯優(yōu)于重度TBI組，提示高水平的EPCs有助于提高TBI后認(rèn)知能力的恢復(fù)。

綜上，TBI大鼠循環(huán)血EPCs的水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，高水平的EPCs有助于改善預(yù)后，可作為判斷預(yù)后的標(biāo)志物。本研究對(duì)以后深入開展的TBI后EPCs參與的血管神經(jīng)修復(fù)機(jī)制研究和調(diào)控EPCs數(shù)量治療TBI的研究奠定了基礎(chǔ)。

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