Nrf2-自噬通路在大鼠切口痛-瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏中的作用

顧喜燕，王志宏，于泳浩

誘導(dǎo)術(shù)后痛覺過敏可增加阿片藥物用量并導(dǎo)致術(shù)后持續(xù)疼痛，該問題一直是瑞芬太尼臨床應(yīng)用的一大困擾［1］，但具體機(jī)制并不完全明確。自噬通常作為一種保護(hù)性細(xì)胞代謝途徑也參與神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展［2］，而且自噬與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切［3］。核因子 E2相關(guān)因子 2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）在應(yīng)激狀態(tài)下可磷酸化入核，啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），增加其下游抗氧化蛋白基因及相關(guān)酶的表達(dá)，是公認(rèn)的抗氧化應(yīng)激的重要樞紐分子［4-5］。目前在瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏中，上述因子的表達(dá)變化鮮有研究報(bào)道。本研究旨在初步探討Nrf2在切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型中的表達(dá)變化及其與自噬、痛敏行為學(xué)的關(guān)系，為瑞芬太尼的術(shù)后痛覺過敏機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 雄性清潔級(jí)SD大鼠24只，2～2.5月齡，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑：鹽酸瑞芬太尼（瑞捷，1 mg）購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，用前以生理鹽水稀釋至10 mg/L；Nrf2激動(dòng)劑叔丁基對(duì)苯二酚（tBHQ）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；抗Beclin-1單克隆抗體、抗LC3Ⅱ單克隆抗體、抗Nrf2單克隆抗體、抗HO-1單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司；抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。YLS-6B智能熱板儀購(gòu)自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 24只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：生理鹽水+切口痛組（I組）、切口痛-瑞芬太尼痛敏組（RI組）、Nrf2激動(dòng)劑組（t-BHQ組），每組8只。I組和RI組建模前分別經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水0.1 mL/（kg·min）和瑞芬太尼1μg/（kg·min），連續(xù)輸注60 min。輸注同時(shí)于雙側(cè)后足建立Brennan切口痛模型。t-BHQ組于輸注瑞芬太尼前0.5 h開始給予腹腔注射Nrf2激動(dòng)劑t-BHQ 15 mg/kg，12 h 1次，連續(xù)4次，余處理同RI組。

1.2.2 切口痛模型建立 大鼠置于50 cm×30 cm×20 cm密閉木箱中吸入七氟醚至不能站立后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠。于鼠尾中下1/3處穿刺留置24號(hào)靜脈留置針，醫(yī)用膠帶固定并以少許生理鹽水封管。按原定方案靜脈輸注生理鹽水或瑞芬太尼。輸注同時(shí)大鼠雙側(cè)后足底消毒后于其后緣正中0.5 cm處向前縱行切開皮膚及筋膜（約1 cm），以眼科鑷挑起跖肌，縱行充分剝離，過程中要注意保持肌肉起止附著點(diǎn)完整。按壓止血后縫合切口，對(duì)合皮膚使其不得重疊、內(nèi)翻或裂開。碘伏消毒切口后涂少量紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.2.3 行為學(xué)測(cè)定 靜脈輸注前24 h（T0），輸注結(jié)束后2 h（T1）、6 h（T2）、24 h（T3）和 48 h（T4）測(cè)定動(dòng)物行為學(xué)變化，包括機(jī)械縮足反應(yīng)閾值（PWT）和熱縮足潛伏期（PWL）。測(cè)定環(huán)境：室溫（18～22℃）、安靜，測(cè)定前實(shí)驗(yàn)鼠先適應(yīng)環(huán)境30 min。采用BSEVF3電子Von Frey纖維絲測(cè)定PWT，將大鼠置于有小網(wǎng)孔，底部懸空放置的金屬籠內(nèi)，以Von Frey纖維絲對(duì)準(zhǔn)右后足第2、3趾間距離切口邊緣約1 cm處垂直施壓，大鼠出現(xiàn)快速縮足、舔足或嘶叫時(shí)停止加壓并記錄該壓力值。測(cè)定間隔為5 min，共測(cè)定5次，去除最大值和最小值，取平均值記錄為PWT值，最大壓力設(shè)定為60 g，增至此壓力無反應(yīng)者剔除。YLS-6B智能熱板儀測(cè)定大鼠右后足PWL，熱板設(shè)為恒溫50℃，記錄大鼠右后足開始接觸熱板至出現(xiàn)回縮、踮腳、掙扎、嘶叫、舐足任一反應(yīng)的時(shí)間，連續(xù)測(cè)5次，間隔5 min，去除最大值和最小值，取平均值記為PWL值。PWL上限定為30 s，超過30 s無反應(yīng)者剔除。

1.2.4 脊髓組織Nrf2-自噬通路相關(guān)蛋白測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試完畢后處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取L4～6脊髓組織，保存于-80℃。Western blot法檢測(cè)脊髓 LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)。冰浴下加入組織蛋白裂解液，研磨脊髓樣本成組織勻漿并提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。取15μg蛋白樣品，沸水（100℃）煮10 min后迅速冷卻，10%SDS-PAGE電泳后，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒壓100 V，60 min），5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入一抗 LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2、HO-1 和內(nèi)參 β-actin（抗體稀釋度均為 1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日經(jīng)30 min復(fù)溫后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），常溫孵育1 h，暗室內(nèi)加入顯色劑，曝光掃描。用Quantity One測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與βactin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痛敏行為學(xué)變化 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3組PWT、PWL呈總體下降的趨勢(shì)（均P＜0.01）。組間比較結(jié)果顯示，T1時(shí)點(diǎn)開始，與I組相比，RI組PWT下降、PWL縮短（P＜0.05）；此時(shí)，tBHQ組較RI組PWT升高、PWL延長(zhǎng)（P＜0.05），見表1、2。

2.2 Nrf2-自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 與I組比較，RI組 LC3Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)升高，Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。而相比 RI組，t-BHQ組Nrf2、HO-1、LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），見圖 1、表 3。

Tab.1 Comparison of PWT at different time points between three groups表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWT比較 （n=8，g，±s）

Tab.1 Comparison of PWT at different time points between three groups表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWT比較 （n=8，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 組間=6.25，F(xiàn) 時(shí)間=644.21，F(xiàn) 交互=4.10，均 P＜0.05；組內(nèi)不同時(shí)間比較：A與 T0比較，B與 T1比較，C與 T2比較，P＜0.05；組間比較：a與I組比較，b與RI組比較，P＜0.05

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Tab.2 Comparison of PWL at different time points between three groups表2 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)PWL的比較 （n=8，s，±s）

Tab.2 Comparison of PWL at different time points between three groups表2 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)PWL的比較 （n=8，s，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 組間=5.05，F(xiàn) 時(shí)間=3 862.44，F(xiàn) 交互=25.66，均 P ＜ 0.05；組內(nèi)不同時(shí)間比較：A與 T0比較，B與 T1比較，C與 T2比較，P＜0.05；組間比較：a與I組比較，b與RI組比較，P＜0.05

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Fig.1 Western blot results of proteins in the Nrf2–autophagy pathways in spinal cord tissues between three groups圖1 3組大鼠脊髓組織Nrf2-自噬通路相關(guān)蛋白Western blot結(jié)果

Tab.3 Comparison of spinal LC3Ⅱ,Beclin-1,Nrf2 and HO-1 at T4between three groups表3 3組大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1 T4時(shí)表達(dá)的比較 （n=8，±s）

Tab.3 Comparison of spinal LC3Ⅱ,Beclin-1,Nrf2 and HO-1 at T4between three groups表3 3組大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1 T4時(shí)表達(dá)的比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與 I組比較，b與 RI組比較，P＜0.05，tBHQ 組與 I組不進(jìn)行比較

組別I組RI組tBHQ組F LC3Ⅱ0.42±0.04 0.86±0.08a 1.14±0.05b 269.41＊＊Beclin-1 0.31±0.03 0.72±0.09a 1.01±0.05b 238.36＊＊Nrf2 0.30±0.05 0.19±0.03a 0.42±0.04b 51.84＊＊HO-1 0.25±0.03 0.17±0.04a 0.35±0.03b 50.53＊＊

3 討論

阿片類藥物誘導(dǎo)痛覺過敏是應(yīng)用阿片類藥物鎮(zhèn)痛過程中出現(xiàn)疼痛感矛盾性增加的一種現(xiàn)象，但目前機(jī)制并不完全清楚［6］。目前，瑞芬太尼作為短效阿片類藥物廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。而誘發(fā)術(shù)后切口痛敏是瑞芬太尼臨床應(yīng)用的一個(gè)主要問題。

在阿片類制劑誘導(dǎo)痛敏的機(jī)制研究中，常測(cè)量用藥前后或干預(yù)因素處理前后對(duì)傷害性刺激的回避反射（甩尾、縮足等）的變化來評(píng)估其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛閾的影響。由于刺激強(qiáng)度急劇變化的傷害性刺激（如熱輻射甩尾實(shí)驗(yàn)）可以掩蓋基線傷害感受閾值的變化，而縮爪試驗(yàn)的緩慢上升刺激曲線（PWT、PWL）克服了這一影響，甚至可以測(cè)得基線感受閾值的細(xì)微變化，所以被臨床前研究廣泛應(yīng)用［7］。自噬通過選擇性或非選擇性分解再利用多余的或結(jié)構(gòu)異常的大分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)來改善細(xì)胞功能、提高細(xì)胞生存率，是一種重要的物質(zhì)代謝方式及保護(hù)機(jī)制。自噬與多種機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)下的適應(yīng)反應(yīng)和修復(fù)過程有著復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)［8］，自噬功能異常影響著機(jī)體內(nèi)包括炎癥反應(yīng)［9］、疼痛過程［2］在內(nèi)的多種生理病理過程，調(diào)節(jié)自噬水平適度活躍對(duì)細(xì)胞代謝顯得尤為重要。Beclin-1、LC3Ⅱ是自噬體形成的起始階段和膜延伸階段的重要蛋白，也是檢測(cè)自噬水平最常用的自噬相關(guān)蛋白［10-11］。Nrf2不僅被認(rèn)為是抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者，同時(shí)是多種自噬凋亡基因的轉(zhuǎn)錄因子［4］并參與自噬的調(diào)節(jié)［12］。故筆者選定了Nrf2及其下游效應(yīng)分子HO-1作為研究觀察蛋白。

參照本課題組的前期研究成果［13］，本研究成功建立了經(jīng)典切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型。與I組相比，從輸注結(jié)束后2 h（T1）開始，RI組PWT下降、PWL時(shí)間明顯縮短，痛敏現(xiàn)象明顯加重。在T4時(shí)RI組大鼠脊髓腰膨大組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白（LC3Ⅱ、Beclin-1）表達(dá)明顯增加、Nrf2及其下游蛋白HO-1表達(dá)下調(diào)，提示瑞芬太尼致切口痛痛敏現(xiàn)象可能與自噬及Nrf2信號(hào)通路活性改變有關(guān)。雖然此前尚無阿片制劑所致痛敏與脊髓內(nèi)自噬基礎(chǔ)活性及相關(guān)自噬通路關(guān)系的報(bào)道，但已有文獻(xiàn)證實(shí)，不同神經(jīng)痛痛敏模型中［脊神經(jīng)結(jié)扎模型（SNL）、慢性壓迫性坐骨神經(jīng)損傷模型（CCI）和坐骨神經(jīng)保留分支損傷模型（SNI）］脊髓自噬相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)各有不同，而蛛網(wǎng)膜下腔注射氯喹抑制脊髓自噬后實(shí)驗(yàn)大鼠PWT明顯降低［2］，提示脊髓自噬與脊髓水平疼痛機(jī)制相關(guān)。相比于RI組，給予t-BHQ后大鼠PWT升高、PWL 延長(zhǎng)，LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2 總蛋白和 HO-1蛋白表達(dá)明顯增加，提示t-BHQ可以改善瑞芬太尼痛敏大鼠模型的痛敏行為學(xué)并增加脊髓自噬活性，而Nrf2-HO-1信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)模型中大鼠脊髓自噬水平參與痛敏的調(diào)節(jié)。結(jié)果提示維持脊髓水平適度自噬活性有利于對(duì)痛敏的控制，與文獻(xiàn)［2］抑制自噬惡化機(jī)械性痛敏的結(jié)果一致。

綜上所述，切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型中脊髓自噬活性及Nrf2蛋白表達(dá)較對(duì)照組均有所改變，而Nrf2-HO-1信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)脊髓自噬參與調(diào)節(jié)了大鼠切口痛-瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛敏反應(yīng)。

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