大黃素對大鼠急性脊髓損傷后繼發(fā)脊髓水腫的影響

曾歡歡，黃英如，李子健，汪 一，張 松

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院針灸骨傷教研室，重慶市400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400016

急性脊髓損傷是脊柱外傷與脊柱手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，至今還沒有有效的治療措施[1]。原發(fā)性脊髓損傷后數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)，會出現(xiàn)復(fù)雜的繼發(fā)性損傷，包括損傷局部脊髓水腫、缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過氧化等[2]。由于受到軟脊膜和硬脊膜等的限制，原發(fā)性脊髓損傷后繼發(fā)的脊髓水腫，將使得脊髓內(nèi)壓增高，導(dǎo)致脊髓內(nèi)微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重脊髓缺血缺氧和細(xì)胞死亡等病理變化。減輕/抑制脊髓損傷后的繼發(fā)性脊髓水腫程度，保護(hù)原發(fā)性脊髓損傷后殘存的神經(jīng)細(xì)胞，對急性脊髓損傷后患者肢體功能恢復(fù)非常重要。

大黃素是從中藥大黃的干燥根中提取的主要活性單體成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[3-4]。大黃素能調(diào)節(jié)肺組織水通道蛋白(aquaporin,AQP)-1和AQP-5的表達(dá)，減輕急性重癥胰腺炎誘導(dǎo)的肺水腫和盲腸穿孔性敗血癥誘導(dǎo)的肺水腫[5-6]。本實(shí)驗(yàn)觀察大黃素對急性脊髓損傷后繼發(fā)性脊髓水腫的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠180只，體質(zhì)量180～200 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SYXK(渝)2012-0001。在實(shí)驗(yàn)過程中對大鼠的處理均按照國家頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》和重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的要求嚴(yán)格執(zhí)行。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、大黃素低劑量組(20 mg/kg，C組)、大黃素中劑量組(40 mg/kg，D組)和大黃素高劑量組(80 mg/kg，E組)[3,7]，每組36只。

1.2 主要試劑、儀器

大黃素，純度≥98%，產(chǎn)品批號A0044：成都曼思特生物技術(shù)有限公司。AQP-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)抗體：美國ABCAM公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體：美國NOVUS公司。Trizol試劑，RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，AQP-4、MMP-2、GAPDH引物：日本TAKARA公司合成。蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin staining,HE)試劑盒：中國索萊寶公司。伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)染料：美國SIGMA公司。CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、T100TMPCR儀：美國BIO-RAD公司。凝膠成像系統(tǒng)：美國ODYSSEY-FC公司。BX51正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。低溫高速離心機(jī)：德國SIGMA公司。

1.3 動物模型及給藥

2%戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定，以T10棘突為中心作2 cm切口，剝離筋膜，切開椎板，暴露T10胸髓，采用Allen法以重10 g打擊棒從2.5 cm高度自由落下撞擊于T10胸髓[8]，逐層縫合傷口。打擊后損傷處脊髓出現(xiàn)出血腫脹，致傷瞬間尾部會痙攣性擺動，雙下肢及軀體回縮撲動后，出現(xiàn)雙下肢癱瘓即為造模成功[9]。

A組僅行手術(shù)暴露。

術(shù)后10 min內(nèi)，C、D、E組分別腹腔注射大黃素溶液20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，A組、B組腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，共28 d。手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作，每只大鼠術(shù)畢予以20萬U青霉素鈉腹腔注射預(yù)防感染，持續(xù)3 d；術(shù)后每天定時給予3次人工膀胱排尿，直至大鼠能夠自主排尿。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分

術(shù)后3 d、7 d、14 d及28 d[10]，每組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行BBB評分[11-12]。評分由熟悉本實(shí)驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行，觀察5 min。每只大鼠測3次，取平均值。在評分前被抽取大鼠應(yīng)檢查其膀胱是否充盈，以免因膀胱充盈而影響評分結(jié)果。

1.4.2 斜板實(shí)驗(yàn)

在術(shù)后3 d、7 d、14 d及28 d，每組隨機(jī)取6只大鼠，將大鼠的身體縱軸放于與木板橫軸垂直的木板上，從水平位置(0°)起逐漸增大木板角度，每次升高5°，以大鼠能夠在木板上停留5 s而不下滑的最大角度作為其神經(jīng)功能值。實(shí)驗(yàn)評分由熟悉本實(shí)驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行。

1.4.3 HE染色

術(shù)后3 d，每組隨機(jī)取3只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于操作臺上，劍突下剪開腹腔，暴露心臟，將灌注針刺入主動脈內(nèi)，剪開右心耳，用微量泵灌注生理鹽水，直到右心耳流出無色液體后，灌注4%多聚甲醛至四肢僵硬。2 h后，以脊髓損傷點(diǎn)為中心，取出頭側(cè)、尾側(cè)約0.5 cm脊髓組織，放入4%多聚甲醛浸泡保存。常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚5 μm。進(jìn)行HE染色，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.4 脊髓含水量測定

術(shù)后3 d，每組隨機(jī)取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后固定，剝離椎旁肌肉，快速取出脊髓組織，以脊髓損傷點(diǎn)為中心，頭側(cè)、尾側(cè)各留取0.5 cm。取出的脊髓標(biāo)本立刻稱其濕重，置于80℃烤箱內(nèi)干燥48 h至恒重，稱其干重；重復(fù)測量3次后取均值，計算脊髓組織含水量。

1.4.5 血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)通透性檢測

使用EB作為示蹤劑，檢測BSCB通透性變化[13]。術(shù)后3 d，各組隨機(jī)取6只大鼠，處死前2 h從股靜脈注入2%EB溶液20 mg/kg，觀察大鼠眼睛、足趾變藍(lán)后，提示染料分布均勻。以斷頭法處死大鼠，取以損傷點(diǎn)為中心的頭側(cè)、尾側(cè)2 cm脊髓，放于甲酰胺3 ml中，54℃水浴24 h后取上清，酶標(biāo)儀在波長632 nm處測量吸光度值，繪制EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算EB含量(μg/g)。

1.4.6 AQP-4、MMP-2 mRNA表達(dá)

采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測 AQP-4、MMP-2 mRNA表達(dá)。術(shù)后3 d，每組隨機(jī)取3只大鼠，取以損傷點(diǎn)為中心的頭側(cè)、尾側(cè)0.5 cm脊髓組織，Trizol裂解后提取總RNA。檢測RNA濃度及純度后，按RR047A試劑盒操作步驟配制反應(yīng)體系，放于T100TMPCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)SYBR Green法配制Mix及反應(yīng)體系后上機(jī)進(jìn)行反應(yīng)。運(yùn)用CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)讀取Ct值。以2-ΔΔCt表示其余四組與假手術(shù)組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系。

重復(fù)3次試驗(yàn)，計算平均值。

上下游引物序列分別見表1。

表1 上下游引物序列

1.4.7 AQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)

采用Western blotting檢測AQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)。術(shù)后3 d，每組隨機(jī)取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后固定并快速取出以損傷點(diǎn)為中心頭側(cè)、尾側(cè)脊髓組織0.5 cm，按1 ml/100 mg比例加入裂解液置于冰上裂解15 min，勻漿后4℃靜置1 h，4℃低溫12000 r/min離心，共15 min，取上清按照BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度，上樣量45 μg，采用Bradford法測定蛋白含量，濃度調(diào)定后等體積上樣，10%分離膠，5%濃縮膠，電泳70 V 30 min后100 V 80 min，恒定電流200 mA 180 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉90 min，一抗孵育過夜(AQP-4 1∶1000，MMP-2 1∶2000，GAPDH 1∶5000)，二抗孵育 1 h，化學(xué)發(fā)光儀顯影，用Image J軟件分析各條帶相應(yīng)值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

術(shù)后3 d、7 d、14 d及28 d，B組BBB評分較A組降低(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d、28 d，C組、D組和E組BBB評分均高于B組(P＜0.05)，且E組BBB評分均高于C組和D組(P＜0.05)。術(shù)后14 d和28 d，D組BBB評分均高于C組(P＜0.05)。見表2。

2.2 斜板實(shí)驗(yàn)

術(shù)后3 d、7 d、14 d及28 d，B組斜板實(shí)驗(yàn)角度較A組降低(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d及28 d，C組、D組和E組斜板實(shí)驗(yàn)角度高于B組(P＜0.05)，且E組斜板實(shí)驗(yàn)角度均高于C組和D組(P＜0.05)。術(shù)后14 d和28 d，D組斜板實(shí)驗(yàn)角度均高于C組。見表3。

2.3 HE染色

術(shù)后3 d，A組偶見少量炎性細(xì)胞核，脊髓組織各形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，各層細(xì)胞排列整齊，無腫脹和出血；B組損傷節(jié)段內(nèi)有大片出血灶，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤，組織間隙增寬，水腫嚴(yán)重；而C、D、E組上述病理改變均有所改善，其中E組改善最明顯，神經(jīng)細(xì)胞破壞最輕。見圖1。

2.4 脊髓組織含水量

術(shù)后3 d，B組脊髓組織含水量較A組增高(P＜0.05)。D、E組脊髓組織含水量低于B組和C組(P＜0.05)，B組和C組間脊髓組織含水量比較無顯著性差異(P＞0.05)，E組低于D組(P＜0.05)。見表4。

2.5 BSCB通透性

術(shù)后3 d，B組EB含量高于A組(P＜0.05)，C組、D組和E組EB含量均低于B組(P＜0.05)，D組和E組低于C組，E組低于D組(P＜0.05)。見表5。

2.6 AQP-4、MMP-2 mRNA表達(dá)

術(shù)后3 d，B組AQP-4、MMP-2 mRNA表達(dá)較A組升高(P＜0.05)，C組、D組和E組AQP-4、MMP-2 mRNA 表達(dá)均低于 B 組(P＜0.05)，E 組 AQP-4、MMP-2 mRNA表達(dá)低于C組和D組(P＜0.05)；D組AQP-4 mRNA表達(dá)低于C組(P＜0.05)。見表6。

2.7 AQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)

術(shù)后3 d，B組AQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)高于A組(P＜0.05)，C組、D組和E組AQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)均低于B組(P＜0.05)，D組和E組均低于C組(P＜0.05)，E組低于D組(P＜0.05)。見表7、圖2。

表2 各組脊髓損傷后各時間點(diǎn)BBB評分

表3 各組脊髓損傷后各時間點(diǎn)斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果(°)

圖1 大鼠脊髓損傷后3 d脊髓組織(HE染色，400×，bar=50 μm)

表4 各組脊髓損傷后3 d脊髓組織含水量(%)

表6 各組脊髓損傷后3 dAQP-4、MMP-2 mRNA表達(dá)

表5 各組脊髓損傷后3 d脊髓組織EB含量(μg/g)

表7 各組脊髓損傷后3 dAQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)(灰度值比值）

圖2 各組脊髓損傷后3 d脊髓組織AQP-4、MMP-2蛋白表達(dá)

3 討論

原發(fā)性脊髓損傷后出現(xiàn)繼發(fā)性脊髓病理變化，將使原發(fā)性脊髓損傷后殘存的神經(jīng)細(xì)胞繼續(xù)受到損害，這是脊髓損傷后肢體功能恢復(fù)困難的重要原因。減輕/抑制脊髓損傷后的繼發(fā)性脊髓損傷，保護(hù)原發(fā)性損傷后殘存的神經(jīng)細(xì)胞，對脊髓損傷后肢體功能恢復(fù)具有重要意義。脊髓損傷后局部內(nèi)環(huán)境平衡被打破，BSCB遭到破壞，在一系列的血管通透性相關(guān)因子、細(xì)胞毒性因子以及炎癥因子的介導(dǎo)下，出現(xiàn)局部水腫和炎癥反應(yīng)[14]，而急性脊髓損傷后脊髓水腫和炎癥將加重神經(jīng)元缺血、缺氧，甚至引起神經(jīng)元死亡。研究證實(shí)[15-16]，急性脊髓損傷后抗水腫、抗炎治療，能保護(hù)原發(fā)性損傷后殘存的神經(jīng)細(xì)胞，有利于脊髓損傷后肢體功能恢復(fù)。大黃素具有抗炎、抗水腫和改善微循環(huán)等藥理作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)針對大黃素治療脊髓損傷進(jìn)行相關(guān)研究。

脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)動物模型較多，其中脊髓打擊傷的動物模型能較好地復(fù)制臨床脊髓損傷病理變化[17]，本實(shí)驗(yàn)選擇Allen法制作脊髓打擊傷模型。通過查閱文獻(xiàn)確認(rèn)，大黃素選擇20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg作為治療劑量[3,7]，給藥方式是腹膜內(nèi)注射給藥，這是由于術(shù)后10 min給藥時，實(shí)驗(yàn)大鼠仍然處于麻醉狀態(tài)，不便口服給藥。主要選擇在脊髓損傷后水腫的高峰期，術(shù)后3 d檢測脊髓水腫主要指標(biāo)[18-19]。

BBB評分和斜板實(shí)驗(yàn)是目前常用的神經(jīng)功能評定法。BBB評分[20]包括后肢功能恢復(fù)過程中幾乎所有的行為學(xué)變化，斜板實(shí)驗(yàn)[21]簡單易操作，皆用于評價大鼠脊髓損傷程度和其后肢的運(yùn)動功能恢復(fù)情況。本實(shí)驗(yàn)BBB評分及斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素高濃度組效果較好。HE結(jié)果顯示，脊髓損傷后，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤，組織間隙增寬，水腫嚴(yán)重，經(jīng)大黃素治療后，上述病理變化顯著減輕，與BBB評分及斜板實(shí)驗(yàn)評分基本吻合。

AQP-4在腦和脊髓中廣泛分布，是在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上高表達(dá)的水通道蛋白，控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)水分的進(jìn)入和排出，具有雙向水通道調(diào)節(jié)的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)[23]，脊髓損傷后AQP-4大量表達(dá)可導(dǎo)致急性脊髓水腫，而抑制AQP-4蛋白表達(dá)可減輕細(xì)胞水中毒和脊髓水腫指數(shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素中、高濃度組脊髓組織含水量與模型組比較降低。AQP-4 mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，各治療組較模型組表達(dá)降低，且具有劑量依賴關(guān)系。這也與BBB評分、HE染色以及脊髓組織含水量趨勢基本吻合，推測大黃素通過抑制急性脊髓損傷后AQP-4表達(dá)，減輕繼發(fā)性脊髓水腫程度，促進(jìn)大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)。

MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員，MMPs是一組鋅依賴肽鏈內(nèi)切酶家族，能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，改變細(xì)胞外微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞遷徙[24-25]。研究顯示[26]，MMP-2參與人類繼發(fā)性脊髓損傷過程，MMP-2高表達(dá)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)破裂，中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，微血管通透性和BSCB通透性增加，血管源性脊髓水腫形成而進(jìn)一步加重脊髓損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷后3 d，MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)增高，大黃素治療后降低。

EB在生理情況下不能透過BSCB，在BSCB被破壞后才可滲漏到脊髓組織中。本實(shí)驗(yàn)通過EB染色檢測BSCB通透性，結(jié)果顯示，大鼠脊髓損傷后EB含量增加，大黃素治療后EB含量降低。因此我們認(rèn)為，急性脊髓損傷后應(yīng)用大黃素治療能下調(diào)MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)，降低BSCB通透性，減輕脊髓水腫程度，達(dá)到對損傷脊髓的保護(hù)作用，這也與HE染色以及AQP-4的表達(dá)基本吻合。

綜上所述，大鼠急性脊髓損傷后應(yīng)用大黃素治療，通過下調(diào)AQP-4和MMP-2表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)BSCB，減輕急性脊髓損傷后水腫程度，這有利于保護(hù)脊髓損傷后殘存神經(jīng)元，促進(jìn)后期肢體功能康復(fù)。除能減輕急性脊髓損傷后的繼發(fā)性脊髓水腫外，大黃素對脊髓損傷后脊髓具體保護(hù)機(jī)制，還需繼續(xù)研究。

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