食源性致病菌RPA檢測技術(shù)研究進(jìn)展

胡金強(qiáng),魏向珂,黃潤娜,孫新城,2,景建洲,2,高 輝,2,耿 堯,2,董彩文,姜春鵬

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院,食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450000;2.河南省食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450000;3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450000)

“民以食為天,食以安為先”[1]。食源性致病菌在全世界廣泛分布,每年導(dǎo)致成千上萬例人類疾病,是世界頭號食品安全問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全球每年有多達(dá)6億人因食用受到污染的食品而患病,其中有42萬人因食源性疾病死亡[2]。在眾多食源性致病菌中,尤以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等影響范圍廣泛[3],對人類身心健康產(chǎn)生極大危害,且造成重大經(jīng)濟(jì)損失,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題。由此可見,開發(fā)食源性致病菌快速檢測技術(shù),防控食源性疾病的發(fā)生與發(fā)展,在食品安全與公共衛(wèi)生方面具有重大意義。

利用傳統(tǒng)檢測方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、多重PCR、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)等檢測食源性致病菌仍存在耗時、操作繁瑣、檢測結(jié)果不準(zhǔn)確等問題[4]。尤其是靈敏度、特異性以及實(shí)用性低等技術(shù)問題,已經(jīng)嚴(yán)重制約了這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此,迫切需要更加靈敏、高效、快速、敏感、特異方法應(yīng)用于食源性致病的檢測[5],以實(shí)現(xiàn)對食源性致病菌的有效監(jiān)控。在這種背景下,重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification,RPA)滿足了食源性致病菌檢測的技術(shù)需求,近年來得到了快速發(fā)展。本文將對RPA及其衍生技術(shù)作簡要介紹。

1 RPA技術(shù)原理與技術(shù)簡介

RPA技術(shù)是一種新型的恒溫擴(kuò)增技術(shù),反應(yīng)模式與PCR相似,不同的是RPA不需要原始的加熱步驟使DNA模板變性,而是利用重組酶引物復(fù)合物掃描雙鏈DNA,進(jìn)而促進(jìn)DNA鏈上同源位點(diǎn)的互換[6]。RPA反應(yīng)所需要的關(guān)鍵酶是能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、DNA單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶[7]。RPA技術(shù)原理如圖1所示[8]:a. 重組酶與長約30～35 nt的引物結(jié)合形成的復(fù)合物在雙鏈DNA模板中尋找靶位點(diǎn);b. 復(fù)合物在模板上定位后可以直接引發(fā)鏈交換反應(yīng)形成D狀環(huán),SSB隨即結(jié)合被置換的DNA鏈,形成D-Loop結(jié)構(gòu),防止引物解離;c. 重組酶-引物復(fù)合物主動水解體系中的ATP導(dǎo)致復(fù)合物構(gòu)象改變,重組酶解離后引物3′端暴露并被鏈置換DNA聚合酶識別,DNA聚合酶按照模板序列在引物3′末端添加相應(yīng)堿基,DNA擴(kuò)增反應(yīng)啟動;d. 鏈置換DNA聚合酶在延伸引物的同時繼續(xù)解開模板的雙螺旋DNA結(jié)構(gòu),DNA合成過程繼續(xù)進(jìn)行;e. 兩條引物擴(kuò)增完成即形成一個完整的擴(kuò)增子[8]。RPA反應(yīng)不需要精確的溫度控制,所有反應(yīng)步驟可在37～42 ℃完成,并且在20 min內(nèi)即可達(dá)到檢測水平[9-10]。除此之外,RPA可實(shí)現(xiàn)對不純樣品的檢測,反應(yīng)試劑可以凍干形式保存使用,不需要再以冷鏈形式儲存運(yùn)輸[11]。

圖1 RPA技術(shù)原理示意圖Fig.1 Schematic of RPA principle

2 RPA及其各個衍生技術(shù)的應(yīng)用

RPA作為等溫擴(kuò)增技術(shù)中的后起之秀[12],結(jié)合了血清學(xué)和分子技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),并克服了兩種方法的缺點(diǎn),是一種簡單、快速、性價比高的診斷工具,能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)驗(yàn)室外的現(xiàn)場精確檢測[13]。并且在RPA基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了其衍生技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展,使RPA的應(yīng)用范圍更加廣泛,技術(shù)更加創(chuàng)新、實(shí)用。

2.1 直接重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Direct-RPA)

Direct-RPA[14]和直接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Direct-PCR)一樣[15],在不進(jìn)行復(fù)雜樣品前處理步驟的情況下,在常溫下就可以進(jìn)行樣品中目標(biāo)基因擴(kuò)增,大大簡化了整個過程分析。

Choi等[16]利用離心Direct-RPA,對被污染牛奶樣品進(jìn)行檢測,以3.2 μL含有4×104個目標(biāo)細(xì)菌的牛奶作為待檢樣品,以沒有被污染牛奶作為陰性對照。在檢測前用熒光基團(tuán)標(biāo)記目的基因。結(jié)果表明,與陰性對照相比,含菌牛奶樣品的熒光信號在反應(yīng)中明顯增強(qiáng),對照組則無變化。另外對細(xì)菌靈敏度也進(jìn)行了檢測,培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行連續(xù)稀釋10倍,在3.2 μL牛奶中細(xì)菌細(xì)胞個數(shù)從4×104～4×100,之后進(jìn)行檢測得出在3.2 μL牛奶中細(xì)菌細(xì)胞個數(shù)最低檢出限為4個細(xì)胞。此方法在30 min內(nèi)可檢出牛奶中的沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌。并且,此實(shí)驗(yàn)無需DNA提取步驟可直接從牛奶樣品中檢測目標(biāo)食源性致病菌。

離心Direct-RPA具有很大優(yōu)勢,包括無需樣品預(yù)處理步驟,反應(yīng)時間短、重復(fù)性好。這些優(yōu)勢賦予了離心Direct-RPA微裝置良好的現(xiàn)場診斷效果,可對食源性致病菌進(jìn)行快速、高靈敏度、高準(zhǔn)確度安全性檢測。然而,Direct-RPA的缺點(diǎn)在于需要離心機(jī)和熒光顯微鏡,在一定程度上失去了現(xiàn)場診斷價值。

2.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增側(cè)流層析技術(shù)(RPA-LFD)

側(cè)流層析試紙條(LFD)目前用于定性、半定量檢測的簡單裝置,用于資源貧乏或非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境[17]。RPA和LFD相結(jié)合可建立一種靈敏、特異、快速與直觀的現(xiàn)場跟蹤目標(biāo)物的檢測系統(tǒng)。

RPA-LFD基于RPA擴(kuò)增原理,利用帶生物素標(biāo)記引物和帶羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),最終擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶FAM和生物素標(biāo)記[18]。LFD前端包被帶FAM抗體的納米金粒,檢測線(T)上包被生物素抗體,當(dāng)反應(yīng)液進(jìn)入試紙條時,帶有FAM和生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物通過抗原抗體結(jié)合作用,在檢測線上形成“生物素抗體-核酸-納米金?！睆?fù)合物顯色。質(zhì)控線上包被抗FAM抗體的固定抗體,可直接與帶FAM抗體的納米金粒結(jié)合,在質(zhì)控線上顯色,以確保試紙條的有效性[19-20]。RPA-LFD檢測可在15～20 min內(nèi)完成,在25～45 ℃的環(huán)境中均可進(jìn)行檢測,最適溫度為35～45 ℃。因此,可用一些簡單的加熱裝備,比如電熱水器甚至體溫便可實(shí)現(xiàn)精確檢測[9-10]。RPA-LFD檢測結(jié)果在橫向流動試紙條上顯示紅色條帶,裸眼就可觀察,即使是非專業(yè)人員也可以直接觀察分析結(jié)果,非常適用于實(shí)地檢測,特別在經(jīng)濟(jì)條件差,資源不足區(qū)域更具良好的應(yīng)用前景[21]。

Kim等[22]運(yùn)用此方法檢測PBS緩沖液和牛奶中的沙門氏菌,RPA反應(yīng)和LFD二者用一個固體裝置連接起來,在此固體裝置上裝有一個單一的激光二極管用于無線控制閥門驅(qū)動,此二極管用于細(xì)菌細(xì)胞熱裂解及等溫擴(kuò)增步驟時進(jìn)行的非接觸加熱,裂解后的細(xì)菌DNA溶液和RPA預(yù)混液在擴(kuò)增室混合進(jìn)行反應(yīng),最后樣品溶液被吸入到LFD試紙條上,5 min后裸眼觀察檢測結(jié)果。整個實(shí)驗(yàn)過程在30 min內(nèi)即可完成。此外,為了獲得高的檢測靈敏度,混有不同稀釋梯度沙門氏菌溶液的1 mL PBS緩沖液和1 mL牛奶在用抗體包裹的磁珠載入椎間盤之前被濃縮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出PBS緩沖液和牛奶中的沙門氏菌檢出限分別為10 CFU/mL和100 CFU/mL。Liu等[23]用RPA-LFD檢測牛奶和雞胸肉中的沙門氏菌,并且在靈敏度、特異性等方面進(jìn)行了研究,優(yōu)化了反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間,和PCR-LFD進(jìn)行了對比,結(jié)果顯示RPA-LFD的檢出限為1.05×101CFU/mL,而PCR-LFD的檢出限為1.05×105CFU/mL,結(jié)果表明RPA-LFD的檢出限比較低,靈敏度高。

RPA-LFD的缺點(diǎn)在于,RPA反應(yīng)產(chǎn)物需要進(jìn)行適度稀釋,如果稀釋不夠,容易造成假陽性結(jié)果,而且開放環(huán)境操作RPA-LFD同樣會造成該方法的假陽性結(jié)果;此外,RPA-LFD最多可進(jìn)行二重食源性致病菌檢測,限制了檢測的效率。

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(RPA-ELISA)

RPA-ELISA,即RPA與ELISA相結(jié)合技術(shù)。該方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增可在40 ℃下、40 min左右完成反應(yīng)。對于標(biāo)記產(chǎn)品進(jìn)行雜交,用特異性5′-生物素與鏈霉親和素標(biāo)記的探針在包被微孔板上進(jìn)行反應(yīng),在室溫下即可進(jìn)行,結(jié)果可用比色法進(jìn)行檢測[24-25]。

Santiago-Felipe等[24]利用RPA-ELISA技術(shù)同時檢測了榛子、花生、大豆、番茄和玉米中的過敏原、轉(zhuǎn)基因啟動子-P35S、轉(zhuǎn)基因終止子-TNOS、病原菌沙門氏菌和阪崎腸桿菌以及霉菌。結(jié)果表明,每個分析物的檢出限為1.3～5.3 μg/g,病原菌菌體濃度為6～13 CFU/mL,不僅比PCR-ELISA的靈敏度與重復(fù)性高,而且RPA-ELISA技術(shù)更適合應(yīng)用于邊遠(yuǎn)地區(qū)、山區(qū)等資源缺乏環(huán)境。

除了RPA-ELISA技術(shù),類似的等溫擴(kuò)增技術(shù)和ELISA技術(shù)結(jié)合使用的還有環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[26]和解旋酶依賴性擴(kuò)增(Helicase-dependent amplification,HDA)[27]。上述技術(shù)具有很多技術(shù)優(yōu)點(diǎn):如不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,可在幾個小時內(nèi)處理幾百個樣品,非常靈活方便。但是與RPA-ELISA相比,這兩種技術(shù)所需溫度或者引物條件較苛刻。比如,RPA-ELISA反應(yīng)溫度在37～42 ℃即可,避免了熱循環(huán),也不需復(fù)雜的引物設(shè)計;HDA-RPA則需要在95 ℃條件下進(jìn)行變性,LAMP-ELISA需要復(fù)雜的引物設(shè)計才能完成接下來步驟[28]。除此之外,RPA-ELISA也是一種快速、低成本的半定量分析技術(shù),在選擇性、靈敏度、重現(xiàn)性以及高通量等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的分析性能。再者,在DNA提取步驟之后,檢測過程可在2 h內(nèi)進(jìn)行完畢,所有樣品在只有一個擴(kuò)增條件和相同檢測技術(shù)下可同時處理。

RPA-ELISA技術(shù)也存在一些缺陷,比如重復(fù)性不好,易出現(xiàn)假陽性,溫度和時間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大。

2.4 實(shí)時重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Real-time RPA)

Real-time RPA,即實(shí)時熒光定量RPA,與Real-time PCR比較,Real-time RPA檢測結(jié)果與前者具有相同的靈敏度與特異性[29],然而Real-time RPA的檢測過程所需時間明顯短于Real-time PCR,即Real-time RPA所需時間是7～15 min,Real-time PCR則需耗時90 min[30],且與Real-time RPA相比,Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)操作設(shè)備較復(fù)雜、昂貴,而且所占空間大、不便攜帶。除此之外,Real-time PCR需要一個熱循環(huán)過程且實(shí)驗(yàn)操作步驟復(fù)雜[31],而Real-time RPA實(shí)驗(yàn)操作溫度在37～42 ℃的條件下便可進(jìn)行,無需復(fù)雜的操作程序。

RPA擴(kuò)增結(jié)果可通過實(shí)時熒光定量檢測[32]。RPA擴(kuò)增的實(shí)時檢測依賴于核酸外切酶Ⅲ,它會切斷exo-探針中的四氫呋喃(THF),導(dǎo)致熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的分離[33-35],擴(kuò)增結(jié)果通過exo-探針檢測。此探針攜帶一個熒光基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán),分別與一個胸腺嘧啶結(jié)合,中間由一個四氫呋喃(THF)堿基隔開,當(dāng)此結(jié)構(gòu)完整時,熒光強(qiáng)度低[36]。當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時,連接熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的THF堿基位點(diǎn)就會被核酸外切酶Ⅲ識別并酶解,下游的淬滅基團(tuán)被釋放,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。酶切后產(chǎn)生的游離3′-OH作為DNA聚合酶的靶點(diǎn)并擴(kuò)增此探針,熒光強(qiáng)度也會隨著其擴(kuò)增而增強(qiáng)[37]。熒光強(qiáng)度信號實(shí)時檢測由熒光信號檢測器[38]或掃描儀[39]完成,其敏感度強(qiáng)、特異性強(qiáng),檢測所需時間短。Kim等[40]用此方法對雞蛋、雞肉和雞湯中的結(jié)腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌進(jìn)行了雙重檢測,實(shí)驗(yàn)在45 ℃溫度條件下進(jìn)行20 min即可完成,結(jié)果顯示在純培養(yǎng)物中結(jié)腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌的檢出限是1 CFU/反應(yīng),在雞湯中的檢出限是1 CFU/mL,在沒有預(yù)富集的情況下雞蛋和雞肉中的檢出限是103CFU/g,經(jīng)過24 h富集培養(yǎng)后雞蛋和雞肉中結(jié)腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌的檢出限是1 CFU/g。并且和另外33種細(xì)菌進(jìn)行了特異性檢測,結(jié)果表明只有空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌是陽性,其余均為陰性。Clancy等[41]使用編碼前導(dǎo)肽酶作為分子診斷靶基因,利用Real-time RPA檢測全血中肺炎鏈球菌,并進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化,并且在靈敏度和檢出限方面和Real-time PCR進(jìn)行對比。結(jié)果顯示兩者的靈敏度相當(dāng),均為100%,Real-time RPA的檢出限是4.0個基因組/反應(yīng),而Real-time PCR的檢出限是5.1個基因組/反應(yīng),二者檢出限也相差不是太多,但是就反應(yīng)動力學(xué)而言,Real-time RPA要比Real-time PCR快得多,僅需20 min即可完成反應(yīng),而后者需要數(shù)小時。除此之外,Real-time RPA也成功實(shí)現(xiàn)了對弗朗西斯土拉熱桿菌[34]、B族鏈球菌[42]、布魯氏桿菌[43]以及產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌[44]等的檢測(表1)。

表1 RPA技術(shù)在食源性致病菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Application of RPA technology for the detection of foodborne pathogenic bacteria

Real-time RPA本身也具有一些缺點(diǎn),例如實(shí)驗(yàn)成本高,需要熒光定量設(shè)備,而且該技術(shù)容易造成交叉污染,導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

2.5 RPA微流體

微流體是一種將樣品準(zhǔn)備、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測結(jié)合于一體的集成設(shè)備,省略了準(zhǔn)備、配制試劑的過程,已廣泛應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域[37]。Hakenberg等[45]首次在微流體系統(tǒng)上成功實(shí)現(xiàn)反應(yīng)試劑的被動層流混合,此系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了芯片微體積的試劑溶解混合,此方法促進(jìn)了RPA研究朝高通量的方向發(fā)展。

Lutz等[46-47]將RPA反應(yīng)與微流體芯片反應(yīng)裝置系統(tǒng)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)實(shí)時檢測。該微流體包括液體反應(yīng)劑的玻璃安瓿和凍干試劑。液體反應(yīng)液包括緩沖液及鎂離子等,凍干試劑包括各種酶、引物及探針等。該系統(tǒng)在裝有孵育器的箔片離心裝置上設(shè)計了幾個小型反應(yīng)腔室。當(dāng)需要檢測時緩沖液和凍干試劑在不同的反應(yīng)腔室中通過離心使兩者混合。這種自動系統(tǒng)可以在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)多個反應(yīng)同時進(jìn)行的極高靈敏度檢測,在實(shí)驗(yàn)中檢測到了少于10個拷貝數(shù)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)。Kersting等[48]把微陣列技術(shù)與多重擴(kuò)增RPA相結(jié)合,在四個反應(yīng)室內(nèi)可同時擴(kuò)增四個反應(yīng)靶標(biāo),擴(kuò)增子通過與熒光基團(tuán)偶聯(lián)的反向寡核苷酸引物進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增和空間分辨信號的產(chǎn)生依賴于環(huán)氧-硅烷化的玻璃表面結(jié)合的固定化正向引物上,此過程在泵驅(qū)動雜交室中完成。在38 ℃下,微陣列技術(shù)和RPA技術(shù)的組合允許在相當(dāng)小的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行多參數(shù)分析,反應(yīng)在20 min內(nèi)完成,實(shí)驗(yàn)得出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌(Salmonellaenterica)的檢出限是10 CFU/mL,淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)的檢出限是100 CFU/mL,實(shí)現(xiàn)了同時檢測淋病奈瑟氏菌、腸炎沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

Tsaloglou等[49]利用微流體滑動芯片與RPA技術(shù)相結(jié)合,檢測出了艱難梭狀芽孢桿菌,芯片上RPA測定的靶向艱難梭菌毒素B基因(tcdB)編碼毒素B,編碼出的其中一種蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)細(xì)菌毒性。該裝置用透明丙烯酸制造,采用快速成型方法。它有六個重復(fù)的500 nL反應(yīng)孔以及兩組500 nL對照孔,反應(yīng)在此裝置上進(jìn)行,用熒光探針進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。該反應(yīng)在20 min內(nèi)完成,實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出艱難梭狀芽孢桿菌的檢出限為1 fg。Eid等[50]在微流體芯片上等速電泳(ITP)與RPA技術(shù)相結(jié)合檢測全血中的單增李斯特菌,在微流體芯片上用ITP進(jìn)行純化處理25 μL樣品量,將細(xì)菌DNA與全血污染物分離,之后將提取的DNA直接轉(zhuǎn)移到RPA預(yù)混液中進(jìn)行等溫孵育和檢測。純化提取DNA和檢測所需總的時間在75 min內(nèi)可以完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測出單增李斯特菌的檢出限是5×103～2×104個細(xì)胞/mL。

RPA微流體雖然集成度較高,但是研發(fā)與使用成本較高,制作與組裝程序復(fù)雜、周期長,推廣使用具有一定難度。

3 總結(jié)與展望

食品是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ),食品安全是關(guān)系到社稷民生的重大問題,食源性致病菌作為食品安全問題的首要隱患,傳統(tǒng)檢測技術(shù)已不能滿足食源性致病菌檢測需求,因此建立快速、靈敏、特異、多重的檢測方法十分必要。RPA技術(shù)作為一個新興的分子檢測技術(shù),到目前為止,不僅在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方面應(yīng)用較多,而且在食源性致病菌檢測方面也開始嶄露頭角。RPA技術(shù)具有諸多技術(shù)優(yōu)勢:不需要熱循環(huán),在室溫37～42 ℃左右即可完成反應(yīng);反應(yīng)時間短,只需15～20 min;攜帶方便,RPA與LFD、ELISA、熒光等技術(shù)結(jié)合可實(shí)現(xiàn)實(shí)地檢測和便攜式攜帶等。然而,RPA技術(shù)也有一些缺點(diǎn)與不足,比如RPA涉及的酶類比較昂貴、檢測對象單一、電泳檢測需對產(chǎn)物進(jìn)行純化等。鑒于此,未來RPA將朝著經(jīng)濟(jì)、高通量、多重化以及更加快速、便攜、敏感、特異的方向發(fā)展,相信在不遠(yuǎn)的將來RPA會在食品安全檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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