原料米對廣東客家黃酒發(fā)酵及產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響

錢 敏,湯斯斯,趙文紅,,*,黃敏欣,許偉萍,李 斌

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510225;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642)

傳統(tǒng)廣東客家黃酒是一種營養(yǎng)豐富的低度甜型釀造酒。原料米被形象地稱為客家黃酒的“酒之肉”[1],對用紅曲釀造的黃酒質(zhì)量有很大影響。已有研究表明,不同原料米為發(fā)酵基質(zhì)對紅曲代謝產(chǎn)物中GABA具有顯著的影響[2-3]。傳統(tǒng)的廣東客家黃酒釀造以糯米為原料,但是由于糯米原料價格昂貴,且產(chǎn)量低,已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需要,因此近年來以傳統(tǒng)糯米為主要原料釀制的黃酒受到一定的負(fù)面影響,生產(chǎn)廠家紛紛尋找成本低、風(fēng)味淡爽、有豐富營養(yǎng)的原料米。目前,除了名優(yōu)黃酒采用糯米為釀酒原料外,普通黃酒大部分采用粳米和秈米為原料。但是工廠實踐經(jīng)驗不足,理論基礎(chǔ)匱乏,因此研究原料米對黃酒營養(yǎng)成分的影響非常重要。

γ-氨基丁酸(GABA)為一種重要的神經(jīng)介質(zhì),促進(jìn)人腦的新陳代謝,并具有降血壓、促進(jìn)長期記憶、活化肝腎以及防止動脈硬化等功能[4-5]。謝廣發(fā)等[6]研究表明,黃酒含有較豐富的GABA,且通過黃酒改善大鼠學(xué)習(xí)與記憶的實驗,推測出豐富的GABA是黃酒提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的原因所在。廣東客家黃酒發(fā)酵過程中的基礎(chǔ)指標(biāo)總糖、總酸、pH和氨基酸態(tài)氮含量是微生物生長代謝和發(fā)酵的重要體現(xiàn),而酒醪中GABA主要來源于微生物的生長代謝;同時,在GABA的生物合成中,存在于微生物體內(nèi)的GAD酶起著重要的作用,是生物催化谷氨酸(Glu)合成GABA的唯一關(guān)鍵限速酶[7-8]。因此這些指標(biāo)可間接說明不同原料米中微生物的生長代謝情況,從而更好地說明不同原料米對客家黃酒產(chǎn)GABA的影響。

本實驗從發(fā)酵基質(zhì)原料米入手,考察了糯米、粳米、秈米在相同發(fā)酵工藝條件下對黃酒中GABA的影響,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)GABA的客家黃酒提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲、麥曲、酒藥 廣東省紫金縣某酒廠提供;糯米 山西豐園食品有限公司;粳米 吉水縣金泰米業(yè)有限公司;秈米 南陵縣永興米業(yè)有限公司;米酒(29度) 廣東石灣酒廠有限公司。

1100系列高效液相色譜儀 美國Agilent科技有限公司;LX-C35L自動電熱壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠;BS223S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;VAL1酒精計 上海一恒科技有限公司;DHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;TG16-W高速離心機 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 廣東客家黃酒的釀造工藝流程

1.2.2 不同原料米客家黃酒發(fā)酵過程中各項指標(biāo)的測定 客家黃酒中總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮測定:按GB/T 13662-2008黃酒國標(biāo)[10]。

1.2.3 不同原料米客家黃酒發(fā)酵過程中GABA含量的測定 a、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:取GABA標(biāo)準(zhǔn)品0.3 g,用流動相定容至100 mL。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL的進(jìn)樣量進(jìn)樣;b、樣品的測定:分別采用糯米、粳米、秈米釀酒,高效液相色譜檢測酒液中GABA含量[11-12]。高效液相色譜檢測GABA的條件:采用紫外檢測檢測器,其檢測波長為340 nm;色譜柱為4.6×150 mm,3.5 μm Agilent氨基酸柱,柱溫為40 ℃;流動相A(NaH2PO4)=0.02 mol/L(pH為7.8);流動相B(V甲醇MeOH∶V乙腈ACN∶V水H2O)=45∶45∶10。

依次吸取0 μL H2O→5 μL緩沖液→1 μL OPA衍生劑→0 μL H2O→10 μL酒樣→0 μL H2O→進(jìn)樣。

表1 高效液相色譜梯度洗脫的程序Table 1 Gradient elution program of high performance liquid chromatography

1.2.4 不同原料米對客家黃酒發(fā)酵過程中GAD酶活性的影響 分別用糯米、粳米、秈米釀造黃酒。從主酵第3 d開始,每隔3 d取2.50 g酒醅。向酒醅中加入5 mL的pH5.8 K3PO4緩沖液(緩沖液中磷酸吡哆醛0.2 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、2-巰基乙醇2 mmol/L),之后磨成勻漿,再進(jìn)行離心,取得上清液。量取2 mL上述上清液,添加1%谷氨酸1 mL,在40 ℃水浴條件下進(jìn)行加熱2 h,接著在90 ℃水浴條件下進(jìn)行加熱滅酶5 min[13],再進(jìn)行冷凍離心,取得上清液,最后過0.45 μm膜,待高效液相色譜測定GABA。每1 h生成1 μmol GABA為一個酶活單位,研究不同原料米對GAD酶活性的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SigmaPlot 11.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,各組實驗數(shù)據(jù)用X±S(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料米對發(fā)酵過程中總糖含量的影響

在發(fā)酵過程中,總糖含量是一個重要指標(biāo)。原料在紅曲、麥曲和酒藥中多種微生物及酶的作用下進(jìn)行邊糖化邊發(fā)酵。前發(fā)酵主要是淀粉的液化糖化,生成以葡萄糖為主的可發(fā)酵性糖,后發(fā)酵則主要是酵母菌利用麥芽糖、葡萄糖這些可發(fā)酵性糖發(fā)酵產(chǎn)酒精,并伴隨著一些新物質(zhì)的合成[14]?？图尹S酒屬于傳統(tǒng)型甜黃酒,按照國標(biāo)(GB/T 13662-2008),傳統(tǒng)型甜黃酒要求總糖(以葡萄糖計)>100 g/L。糯米、粳米、秈米黃酒的總糖含量均達(dá)到要求,說明在總糖的理化指標(biāo)下,糯米、粳米、秈米均適合釀造黃酒。

從圖1可看出,在主發(fā)酵階段0～6 d內(nèi),糯米、粳米總糖濃度大體均呈下降趨勢,秈米稍有波動,后發(fā)酵(第6 d加入白酒后)從開始到后期,三者總糖含量先在6～9 d不斷下降，第9 d后總體持平，貯藏一個月后,粳米、糯米、秈米的總糖含量分別為297、272、253.2 g/L。然而,無論是前發(fā)酵還是后發(fā)酵,總糖含量為粳米>糯米>秈米,這說明粳米和糯米易于糖化,產(chǎn)生較多的糖類物質(zhì),能為微生物的生長代謝提供較多的營養(yǎng)物質(zhì),更適宜釀造黃酒。也說明了在發(fā)酵基質(zhì)粳米和糯米中,微生物有較強的生命活動。同時,發(fā)酵過程中,酒體的糖度不同,會影響微生物在期間的發(fā)酵情況,糖度高,營養(yǎng)物質(zhì)較多,微生物生長旺盛,進(jìn)而將影響微生物的代謝產(chǎn)物。

圖1 不同原料米對發(fā)酵過程中總糖含量的影響Fig.1 Effects of different rice on content of total sugar during fermentation process

2.2 不同原料米對發(fā)酵過程中總酸含量的影響

總酸對酒的品質(zhì)和酸敗十分重要,酸度是實際生產(chǎn)中需要檢測的一項指標(biāo)。黃酒中總酸(以乳酸計)在發(fā)酵過程中主要由乳酸桿菌產(chǎn)生,且酵母發(fā)酵利用糖來產(chǎn)生酒精的同時,也產(chǎn)生少量有機酸,這都造成總酸的變化。

從圖2可以看出,主酵階段0～6 d，糯米黃酒的總酸含量不斷上升，而粳米、秈米幾乎不發(fā)生變化。后酵階段(第6 d加入白酒后)，在第6～9 d時三者總酸含量急速下降，第6～18 d時三者總算含量均不斷上升，第18 d后糯米、粳米的總酸含量繼續(xù)上升，而秈米則略有所下降，三者在第21 d后含量趨于穩(wěn)定。原因在于,后酵剛開始時,發(fā)酵醪液被加入的白酒稀釋,造成總酸含量低;之后一部分產(chǎn)酸菌和酵母快速繁殖,生命活動旺盛,產(chǎn)酸菌產(chǎn)生大量有機酸,酵母則發(fā)酵產(chǎn)酒精和少量有機酸,使得總酸不斷上升,在第12 d時糯米、粳米、秈米的總酸含量分別達(dá)到6.10、4.3、4.9 g/L;當(dāng)達(dá)到一定酸度和酒精度后,再繼續(xù)發(fā)酵時,產(chǎn)酸菌的活性會受到抑制,發(fā)酵到后期，總酸含量趨于穩(wěn)定，后酵的21 d后,總酸含量為糯米>粳米>秈米,貯藏一個月后,糯米、粳米、秈米的總酸含量分別達(dá)到7.08、5.6、4.9 g/L。

圖2 不同原料米對發(fā)酵過程中總酸含量的影響Fig.2 Effects of different rice on content of total acid during fermentation process

按照國標(biāo)(GB/T 13662-2008),傳統(tǒng)型甜黃酒要求總酸(以乳酸計)的范圍:4.0～8.0 g/L,在本實驗中,糯米、粳米、秈米黃酒整個發(fā)酵過程中的總酸含量都符合要求,說明在總酸這個指標(biāo),糯米、粳米、秈米都可用來釀造黃酒。然而,在整個發(fā)酵過程中糯米黃酒的總酸含量最高,說明黃酒釀造時,糯米作為原料產(chǎn)酸較多,微生物的生長代謝活躍,可使酒的風(fēng)味更好[15]。同時,發(fā)酵基質(zhì)的不同導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境的酸堿度不同,這會造成微生物的生長環(huán)境不同,直接影響微生物的代謝活動。

2.3 不同原料米對發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的影響

氨基酸態(tài)氮含量體現(xiàn)客家黃酒發(fā)酵過程中氨基酸及小肽總體水平,可用于評判客家黃酒成品的優(yōu)劣。按照國標(biāo)(GB/T 13662-2008),傳統(tǒng)型甜黃酒氨基酸態(tài)氮含量:≥0.40 g/L為優(yōu)級黃酒,≥0.35 g/L為一級黃酒,≥0.30 g/L為二級黃酒。

3種原料客家黃酒的氨基酸態(tài)氮含量總體都呈上升趨勢,氨基酸態(tài)氮含量為糯米>粳米>秈米。糯米、粳米原料釀出的黃酒在整個發(fā)酵過程中的氨基酸態(tài)氮含量超過0.40 g/L,為優(yōu)級黃酒,而秈米黃酒在發(fā)酵后期(第6 d加入白酒后)和貯藏后(30 d后)氨基酸態(tài)氮含量低于0.40 g/L但≥0.35 g/L,為一級黃酒,說明在氨基酸態(tài)氮這個指標(biāo),本實驗里糯米、粳米、秈米都可用于黃酒的釀造。從實驗結(jié)果來看,氨基酸態(tài)氮含量雖然受原料米中蛋白質(zhì)含量的影響,但微生物利用原料的情況對其影響更大。糯米、粳米黃酒氨基酸態(tài)氮含量較多,與秈米黃酒差異明顯,這說明糯米和粳米被各種酶和微生物分解利用的程度高,同時也說明微生物在糯米和粳米的發(fā)酵基質(zhì)中生長代謝旺盛。

圖3 不同原料米對發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effects of different rice on content of amino nitrogen during fermentation process

2.4 不同原料米對發(fā)酵過程中GABA含量的影響

2.4.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖4、圖5可知,GABA出峰時間是14.098 min,和其他氨基酸不重疊,說明此方法對定量分析客家黃酒中GABA具有較高準(zhǔn)確性,圖6可看出此方法可以較好地分開客家黃酒中GABA和其他氨基酸。GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=214.5536x+1.5632(y為峰面積,x為響應(yīng)值),相關(guān)系數(shù)為0.99972。GABA的峰面積與其進(jìn)樣量在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,因此能較準(zhǔn)確地對客家黃酒中的GABA進(jìn)行定性定量分析。

圖4 GABA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.4 Figure of GABA standard by high performance liquid chromatography

圖5 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.5 Figure of amino acid standard by high performance liquid chromatography

圖6 客家黃酒中氨基酸和GABA高效液相色譜圖Fig.6 Figure of amino acid and GABA of hakka rice wine by high performance liquid chromatography

2.4.2 樣品的測定 由圖7可看出,糯米、粳米、秈米在發(fā)酵過程中GAGB含量的變化呈波動狀態(tài)。主酵期間(0～6 d),GAD將Glu脫羧生成GABA,GABA含量呈現(xiàn)上升的趨勢。第6 d加入白酒后,白酒稀釋了醪液,GABA含量下降;在后酵的9～18 d,隨著發(fā)酵醪液酒精度的上升,耐酒精的酵母等繼續(xù)代謝生成GABA,而不耐酒精的部分糖化菌其GABA生成則受到阻礙,同時,發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行使得細(xì)胞內(nèi)溶液pH上升,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶活性上升,致使部分GABA被降解損失,因此GAGB呈現(xiàn)波動狀態(tài),變化不明顯;到了后酵的第21～30 d,部分微生物死亡,體內(nèi)部分GABA溶出,導(dǎo)致GABA含量上升。發(fā)酵過程中,GABA含量糯米最高,粳米次之,秈米最低,貯藏一個月后,糯米GABA含量達(dá)到260.45 mg/L,分別為粳米、秈米的1.13倍、1.44倍。這是因為,原料米是傳統(tǒng)使用的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),原料米品種不同,米中蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下,生成的氨基酸等小分子物質(zhì)的種類和數(shù)量不同,因此GAD可以作用的底物濃度有差異,引起GAD表達(dá)的差異,使得產(chǎn)生GABA含量不同。同時,因為原料米的營養(yǎng)成分、米飯的粘性和吸水性不同,米飯硬或者蓬松,這直接影響發(fā)酵環(huán)境。因此微生物在不同原料米中的發(fā)酵情況不同,進(jìn)而可能影響微生物的生長和代謝產(chǎn)物GABA的生成。還有研究報道指出,GAD的表達(dá)會受到其編碼基因表達(dá)的影響[16]。

圖7 不同原料米對發(fā)酵過程中GABA含量的影響Fig.7 Effects of different rice on GABA content during fermentation process

2.5 不同原料米對發(fā)酵過程中GAD酶活性的影響

GAD是GABA合成的關(guān)鍵酶,GABA的積累是GAD催化的酶促反應(yīng)。GAD是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,其酶活性直接影響GABA的生成量。

從圖8可知,在發(fā)酵過程中,不同品種的原料米釀造的客家黃酒GAD酶活性不同。糯米、粳米黃酒的GAD酶活性較大且兩者接近,而秈米GAD酶活性較小,與糯米、粳米相差較大,結(jié)果與圖7 GABA的結(jié)果對應(yīng)。在發(fā)酵過程中,GAD酶有差異,可能是因為原料基質(zhì)不同,導(dǎo)致原料被各種酶分解的情況不同,造成微生物可利用的營養(yǎng)物質(zhì)有所差異,使得微生物在其中的發(fā)酵情況不同,最終導(dǎo)致酒體環(huán)境不同,例如pH不同,會導(dǎo)致GAD的酶活性不同。

圖8 不同原料米對發(fā)酵過程中GAD酶活性的影響Fig.8 Effects of different rice on GAD activity during fermentation process

3 結(jié)論

在總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮指標(biāo)下,糯米、粳米、秈米都適合釀造客家黃酒,但糯米黃酒、粳米黃酒總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮含量較高,因為在糯米黃酒、粳米黃酒發(fā)酵過程中微生物的生命活動較劇烈;發(fā)酵過程中,GABA含量糯米黃酒最高,粳米黃酒次之,秈米黃酒最低;貯藏一個月后,糯米黃酒GABA含量達(dá)到260.45 mg/L,分別為粳米黃酒、秈米黃酒的1.13、1.44倍。糯米、粳米黃酒的GAD酶活性較大且兩者接近,而秈米GAD酶活性較小,與糯米、粳米相差較大。綜上所述,對比三種原料米,糯米最有利于客家黃酒的發(fā)酵及產(chǎn)GABA,粳米次之,秈米較不利。

原料米對廣東客家黃酒產(chǎn)GABA有一定影響,原料米的化學(xué)成分、持水特性、比表面積、導(dǎo)熱率、硬度、孔隙度及孔隙分布等是否是影響黃酒發(fā)酵的重要因素需深入研究。同時,早、中、晚稻對廣東客家黃酒產(chǎn)GABA和GAD酶是否差異,仍可做進(jìn)一步的分析研究。解析原料米的這些性質(zhì)和發(fā)酵產(chǎn)物GABA的關(guān)系,為探究發(fā)酵基質(zhì)特性結(jié)構(gòu)對微生物環(huán)境以及微生物代謝產(chǎn)生GABA提供理論依據(jù)。

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