氯嘧磺隆降解菌的篩選及對(duì)污染土壤的生物修復(fù)

王海蘭 ,臧海蓮 ,成 毅 ,安雪姣 ,徐春紅 ,李春艷 * (.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,黑龍江 哈爾濱5000；.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 0008；.牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司,黑龍江 牡丹江 57000)

氯嘧磺隆是美國(guó)杜邦公司于20世紀(jì)80年代研制的一種磺酰脲類除草劑,被廣泛用于大豆田選擇性防除闊葉雜草、莎草及某些禾本科雜草.該除草劑殘效期長(zhǎng)(2～3年),長(zhǎng)期大量重復(fù)施用極易對(duì)后茬敏感作物產(chǎn)生藥害,阻礙大豆田的合理輪作,對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康存在著巨大的潛在威脅[1-2].磺酰脲類除草劑在土壤中的降解主要包括光解、化學(xué)水解和微生物降解,其中微生物降解技術(shù)因具有時(shí)間短、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[3-5].因此,獲得可修復(fù)氯嘧磺隆污染土壤的高效降解菌株以減輕氯嘧磺隆對(duì)后茬作物的藥害及環(huán)境的污染具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[6-10].

目前,一些氯嘧磺隆降解微生物已被分離和鑒定,主要有曲霉菌屬、芽孢桿菌屬、念珠菌屬、鏈霉菌屬、假單孢菌屬、諾卡氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、擲孢酵母屬、叢梗孢科曲霉屬等[11-15].除對(duì)降解微生物分離鑒定及降解條件優(yōu)化外,研究人員還考察了部分菌種對(duì)氯嘧磺隆污染土壤的修復(fù)能力,汪佳秀等[16]利用克雷伯氏菌研究了其對(duì)被氯嘧磺隆污染土壤的生物修復(fù)作用,并以小麥、玉米、黃瓜為供試植物,研究了該菌株對(duì)氯嘧磺隆藥害的緩解作用.但是,利用膠紅酵母菌修復(fù)氯嘧磺隆污染土壤的研究尚未有報(bào)道.

本研究分離獲得 1株能以氯嘧磺隆為唯一碳源生長(zhǎng)的氯嘧磺隆高效降解菌,根據(jù)菌株最佳降解條件,考察土壤溫度、土壤pH值、土壤含水量以及接種量對(duì)降解菌降解土壤中氯嘧磺隆的影響,優(yōu)化菌株對(duì)土壤中氯嘧磺隆的降解條件.通過敏感作物盆栽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降解菌對(duì)氯嘧磺隆污染土壤的修復(fù)效果.以期豐富氯嘧磺隆降解菌菌種資源,降低殘留氯嘧磺隆對(duì)后茬作物的藥害,為實(shí)際氯嘧磺隆污染土壤修復(fù)提供有價(jià)值的參考.

1 材料與方法

1.1 菌株篩選及土壤采集

污泥樣品采自江蘇某激素研究所污水處理池(連續(xù)生產(chǎn)磺酰脲類除草劑20余年).

供試土壤為經(jīng)檢測(cè)無氯嘧磺隆殘留的自然土(NS),取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田,取 0～30cm 深耕層土壤,過篩(孔徑 2mm)、風(fēng)干后備用,用于進(jìn)行氯嘧磺隆污染土壤生物修復(fù)試驗(yàn)、盆栽試驗(yàn).經(jīng)測(cè)定可知:土壤 pH 6.23,全氮含量 93.5mg/kg,全磷含量為 42.1mg/kg,全鉀含量為 416.9mg/kg,含水率為3.6%.

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液:K2HPO40.1g,CaSO40.04g,MgSO4·7H2O 0.2g,NaCl 0.1g,(NH4)2SO40.1g,FeSO4·7H2O 0.001g,加蒸餾水至 1L,121℃滅菌30min.

YPD 培養(yǎng)基(酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基):酵母膏 10g,蛋白胨 20g,葡萄糖 20g,加蒸餾水至 1L,112℃滅菌20min.

以上培養(yǎng)基在配制固體培養(yǎng)基時(shí)按2%添加瓊脂粉,按照實(shí)驗(yàn)要求調(diào)節(jié)pH值.

1.3 主要儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用氯嘧磺隆(分析純,96.02%)購(gòu)自江蘇激素研究所有限公司.Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000購(gòu)自TaKaRa公司;所用有機(jī)試劑均為色譜純,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.所用引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

使用的主要儀器有:AgelienT1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷輪)、SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化)、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊)、YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊)、TU-1810分光光度計(jì)(北京普析)等.

1.4 氯嘧磺隆降解菌分離

采用富集培養(yǎng)方法,以氯嘧磺隆為唯一碳源,富集培養(yǎng)污泥樣品.具體步驟如下:取污泥樣品10g放入裝有90mL無菌生理鹽水和玻璃珠三角瓶中,振蕩約20s至樣品形成均勻懸濁液.以10%接種量轉(zhuǎn)接于裝有 40mL氯嘧磺隆無機(jī)鹽培養(yǎng)基 250mL三角瓶中,氯嘧磺隆濃度為 100mg/L,置于 30℃,165r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng),每隔 7d按10%接種量接入新鮮氯嘧磺隆無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,以一定濃度梯度提高氯嘧磺隆含量,至終濃度達(dá)到 1000mg/L,如此馴化約 2個(gè)月[17].于氯嘧磺隆終濃度為 500mg/L基礎(chǔ)無機(jī)鹽平板上采用平板劃線法分離純化 3～4次,選擇生長(zhǎng)較好的菌株分別回接于含 100mg/L氯嘧磺隆無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液中,測(cè)量其生長(zhǎng)量(OD600)及降解率,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究.

1.5 氯嘧磺隆降解菌鑒定

采用平板劃線法將氯嘧磺隆降解菌接種于無機(jī)鹽基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基,30℃恒溫培養(yǎng)5d后觀察菌落形態(tài).

利用細(xì)菌16S rDNA的27F/1492R通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'和1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',ITS序列的通用引物 ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-C-3'及酵母菌26S rDNA的D1/D2通用引物N L1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和 NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'分別擴(kuò)增降解菌株的16S rDNA區(qū)域序列、ITS1-5.8S-ITS2的ITS區(qū)域序列和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列.擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10×buffer (Mg2+) 5μL,dNTPs(2mmol/L) 4μL,上下游引物(20pmol/μL)各 1μL,菌體 DNA(50ng/μL) 1μL, Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.5μL,加ddH2O至50μL. PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min,94℃ 30s,56℃ 30s, 72℃ 90s,3 0個(gè)循環(huán),72℃ 10min.測(cè)序結(jié)果提交 NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,采用軟件DNAMAN 8.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 氯嘧磺隆降解菌降解率測(cè)定

氯嘧磺隆濃度采用高效液相色譜 Waters 600檢測(cè).色譜柱為 symmetry-C18反相柱(250mm×4.6mm,i.d.5μm),紫外檢測(cè)器為 Waters 2487,流動(dòng)相為甲醇:水=70:30(V/V),冰乙酸調(diào)節(jié)pH 值,流量 1.0mL/min,波長(zhǎng) 254nm,進(jìn)樣量 20μL,柱溫 25℃.氯嘧磺隆采用外標(biāo)法定量分析.采用Empower Software(Waters,MA,USA)記錄和計(jì)算氯嘧磺隆峰面積,得出菌株LCY-4氯嘧磺隆降解率[18-19].

降解率計(jì)算公式:

式中:A0-未接菌對(duì)照培養(yǎng)液中氯嘧磺隆含量;A-接菌處理培養(yǎng)液中氯嘧磺隆含量.

1.7 氯嘧磺隆降解菌降解條件優(yōu)化

分別以24、26、28、30、32、34、36、38℃作為溫度實(shí)驗(yàn)組,分別以5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5作為pH值實(shí)驗(yàn)組,分別以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%作為接種量實(shí)驗(yàn)組.以上各實(shí)驗(yàn)組均使用 100mL含氯嘧磺隆濃度為100mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)液.每實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理,同時(shí)設(shè)加藥但不加菌懸液的處理為對(duì)照.180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5d后,分別測(cè)定菌株生長(zhǎng)量OD600及氯嘧磺隆降解率,考察不同因素對(duì)LCY-4降解氯嘧磺隆的影響.

1.8 氯嘧磺隆降解菌對(duì)污染土壤中氯嘧磺隆降解條件優(yōu)化

1.8.1 降解菌對(duì)滅菌及未滅菌污染土壤中氯嘧磺隆的降解 在降解菌降解條件優(yōu)化基礎(chǔ)上,土壤中添加氯嘧磺隆濃度為 10mg/kg (干土),檢測(cè)降解菌LCY-4在滅菌土壤及未滅菌土壤中的降解率,同時(shí)設(shè)定未投加降解菌LCY-4的滅菌土壤及未滅菌土壤作為對(duì)照組.

1.8.2 不同因素對(duì)降解菌降解土壤中氯嘧磺隆的影響 取過篩土壤 50g,氯嘧磺隆添加量為10mg/kg (干土).分別以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%作為接種量實(shí)驗(yàn)組,分別以20、25、28、30、33、38℃作為溫度實(shí)驗(yàn)組,分別以5.0、5.5、6.0、6.75、7.0、7.5、8.0作為土壤pH值實(shí)驗(yàn)組,分別以 10%、20%、30%、40%、50%、60%為土壤含水量實(shí)驗(yàn)組.除接種量實(shí)驗(yàn)組外,其他各組均以2.5%的接種量接種LCY-4;除培養(yǎng)溫度實(shí)驗(yàn)組外,其他各組均于28℃條件下培養(yǎng);除土壤pH值實(shí)驗(yàn)組外,其他各組土壤均為自然pH值(6.75);除土壤含水量實(shí)驗(yàn)組外,其他各組土壤含水量均為田間最大持水量的40%.靜息培養(yǎng)30d后,采用高效液相色譜測(cè)定氯嘧磺隆殘留量,計(jì)算降解率.

整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段適時(shí)補(bǔ)水,保持含水量不變,每實(shí)驗(yàn)設(shè) 3個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)加藥但不加菌懸液的處理為對(duì)照.在以上最佳降解條件下,靜息培養(yǎng) 30d后采用高效液相色譜測(cè)定氯嘧磺隆殘留量,計(jì)算降解率.

1.9 氯嘧磺隆降解菌對(duì)污染土壤上小麥苗期生長(zhǎng)的影響

土壤過篩,分裝于花盆中,每盆3kg,空白對(duì)照組只添加土壤;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組添加氯嘧磺隆濃度為10mg/kg的土壤,配制好的藥液均勻噴灑在土上,邊噴邊攪拌,使藥液與土壤混拌均勻;實(shí)驗(yàn)組將降解菌LCY-4以2.5%接種量添加于氯嘧磺隆濃度為10mg/kg的土壤中.所有處理于28℃條件下靜息培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)階段保持含水量恒定[18].

投加降解菌10d后,選取經(jīng)清水浸種、催芽、萌發(fā)一致的小麥種子,分別播種于各處理土壤中,每盆播種10粒.于28℃條件下靜息培養(yǎng),第3d時(shí)測(cè)定出苗率,繼續(xù)培養(yǎng)15d后測(cè)定幼苗株高,幼苗根長(zhǎng),植株鮮重,用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行相關(guān)分析.

1.10 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為 3次重復(fù)的平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和制圖采用Origin8.0軟件完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 氯嘧磺隆降解菌的篩選

采用富集、馴化培養(yǎng)方法,從連續(xù)生產(chǎn)磺酰脲類除草劑20余年的江蘇某激素研究所污水處理池污泥樣品中分離出1株氯嘧磺隆降解菌,該菌株能以氯嘧磺隆為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng),對(duì)氯嘧磺隆具有較高的降解能力,命名 LCY-4.LCY-4的菌體形態(tài)呈卵形或球形,大小為 2.0～5.0μm,單一、成對(duì),不形成子囊孢子或擔(dān)孢子.單一菌落形態(tài)為圓形,表面凸起,邊緣整齊,不透明,濕潤(rùn),粘稠,在 YPD培養(yǎng)基上菌落為橙紅色.在液體培養(yǎng)基中,液體表面不形成菌膜,菌液均勻混濁,無起泡現(xiàn)象.

2.2 氯嘧磺隆降解菌分子生物學(xué)鑒定

圖1 菌株 LCY-4 基于26S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 A phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence of strain LCY-4

以菌株基因組DNA為模板,以16S rDNA的通用引物 27F/1492R、ITS區(qū)的通用引物ITS1/ITS4及26S rDNA的通用引物NL1/NL4對(duì)菌株LCY-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示,菌株LCY-4的5.8s ITS區(qū)段基因序列與 Rhodotorula mucilaginosa同源性最高,達(dá)99%;菌株LCY-4的26Sr DNA區(qū)段序列與Rhodotorula mucilaginosa聚為一族,與菌株 Rhodotorula mucilaginosa CBS428(AF189661)的相似度為99.95%(系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖 1).確定菌株 LCY-4為膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)的一個(gè)菌株.菌株LCY-4序列已在GenBank中注冊(cè),登錄號(hào)為JF506740.

2.3 氯嘧磺隆降解菌降解條件優(yōu)化

圖2 不同因素對(duì)降解菌LCY-4生長(zhǎng)及氯嘧磺隆降解能力的影響Fig.2 Effects of different factors on strain LCY-4 growth and chlorimuron-ethyl degradation

不同因素對(duì)菌株LCY-4生長(zhǎng)量及氯嘧磺隆降解率影響見圖2. LCY-4的最適生長(zhǎng)及降解溫度為28℃,此溫度下其最大生長(zhǎng)量及降解率分別為1.70和81.03%.菌株LCY-4的最佳生長(zhǎng)及降解 pH值為 6.0,其最大生長(zhǎng)量及降解率分別為1.532和82.46%.菌株LCY-4在接種量為2.5%時(shí),生長(zhǎng)量為 1.68,此時(shí)降解率亦達(dá)到最大 81.1%.最佳條件下,在含100mg/L氯嘧磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后,菌株LCY-4降解率為87.33%.

2.4 氯嘧磺隆降解菌對(duì)污染土壤中氯嘧磺隆降解條件優(yōu)化

2.4.1 降解菌對(duì)土壤中氯嘧磺隆的降解能力圖3表示土壤中氯嘧磺隆初始濃度10mg/kg (干土),降解菌 LCY-4在滅菌土壤及未滅菌土壤中的降解曲線.由圖 3可知,滅菌的對(duì)照組(CK1)氯嘧磺隆本身存在一定程度的降解,在第 30d氯嘧磺隆降解率達(dá)到 9.03%,表明土壤中氯嘧磺隆的降解有一部分是非生物作用引起的,而未滅菌的對(duì)照組(CK2)在0～10d氯嘧磺隆降解效果與CK1區(qū)別不大,在15～30d降解率逐漸升高,第30d氯嘧磺隆降解率達(dá)到36.87%,說明氯嘧磺隆的添加可能誘導(dǎo)了某些自然狀態(tài)下土著微生物對(duì)氯嘧磺隆降解作用,但作用緩慢且降解率較低[18].

投加降解菌LCY-4于滅菌的氯嘧磺隆污染土壤處理組(TR1)降解率明顯高于對(duì)照組(CK1),第30d菌株LCY-4在TR1處理中對(duì)氯嘧磺隆的降解率為 81.54%,表明降解菌 LCY-4對(duì)氯嘧磺隆有較高的降解能力.降解菌LCY-4投加于未滅菌的氯嘧磺隆污染土壤處理組(TR2)降解率略高于降解菌LCY-4投加于滅菌氯嘧磺隆污染土壤處理組(TR1),第30d菌株LCY-4在TR2處理組中的降解率達(dá)到 85.21%,表明降解菌株 LCY-4添加提高了土壤中氯嘧磺隆的降解.后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇未滅菌的自然土壤作為研究對(duì)象.

2.4.2 菌株對(duì)土壤中氯嘧磺隆降解條件的優(yōu)化 不同因素對(duì)菌株LCY-4降解土壤氯嘧磺隆的影響見圖4.降解菌株LCY-4以不同的接種量添加到土壤中,其降解效果如圖 4a所示.降解菌的加入,促進(jìn)了土壤中氯嘧磺隆的降解.盡管微生物只有在數(shù)目上達(dá)到一定規(guī)模才能實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的高效降解,但接種量并非越大越好,當(dāng)接種量達(dá)到一定程度后,繼續(xù)增加接種量對(duì)底物降解能力影響不大,實(shí)際應(yīng)用不經(jīng)濟(jì),尋求能達(dá)到氯嘧磺隆降解要求的最適接種量有利于生物修復(fù)過程中菌種培養(yǎng)的成本控制[19-20].菌株LCY-4在接種量為 2.5%和 3.0%時(shí),降解率分別為 83.74%和84.11%,差別相對(duì)較小,后續(xù)實(shí)驗(yàn)以 2.5%的接種量添加.

圖3 降解菌株 LCY-4 在滅菌土壤及未滅菌土壤中對(duì)氯嘧磺隆的降解Fig.3 Chlorimuron-ethyl degradation by strain LCY-4 in sterile and unsterile soil

培養(yǎng)溫度對(duì)高效降解菌LCY-4降解氯嘧磺隆的影響結(jié)果見圖 4b.結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)溫度的升高降解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在 25～30℃范圍內(nèi),降解菌株整體降解能力較好,降解率均在 70%以上,其最高降解率出現(xiàn)在 25℃,為87.66%,較高溫度對(duì)降解菌株降解能力的抑制作用明顯,當(dāng)溫度升至 28℃時(shí),降解率略有降低,為82.27%.

土壤pH值對(duì)高效降解菌LCY-4降解氯嘧磺隆的影響結(jié)果見圖4c.結(jié)果表明,在土壤pH為5.0～8.5范圍內(nèi),菌株降解能力均大于 50%,表明降解菌LCY-4具有較強(qiáng)的土壤適應(yīng)性,當(dāng)pH值低于6.0時(shí),LCY-4的降解能力隨pH值的升高而增強(qiáng),當(dāng)pH值高于6.0時(shí),菌株降解能力隨之減弱.菌株LCY-4的最適降解pH值為6.0,此條件下降解率為88.33%.

土壤含水量對(duì)高效降解菌LCY-4降解氯嘧磺隆的影響結(jié)果見圖 4d.結(jié)果表明,當(dāng)土壤中含水量為田間最大持水量的 10%～60%范圍內(nèi),降解菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力,當(dāng)土壤中含水量在 10%～30%之間,菌株降解能力隨著含水量的升高而升高,當(dāng)含水量在 30%～40%之間時(shí),降解率隨著含水量升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)含水量在40%～60%之間時(shí),降解率隨之呈現(xiàn)出緩慢下降趨勢(shì),變化不大.當(dāng)菌株LCY-4在含水量為30%時(shí),降解率最高,為86.33%.

圖4 不同因素對(duì)土壤中氯嘧磺隆降解的影響Fig.4 Effects of different factors on chlorimuron-ethyl degradation by strain LCY-4 in soil

最佳條件下,當(dāng)接種量 2.5%、溫度 25℃、pH 6.0、土壤含水量 30%時(shí),靜息培養(yǎng) 30d后,氯嘧磺隆降解率達(dá)到 90.74%,表明氯嘧磺隆高效降解菌 LCY-4對(duì)土壤中的氯嘧磺隆存在較高的降解能力.

2.4.3 降解菌株對(duì)氯嘧磺隆污染土壤的修復(fù)作用 播種小麥3d后,出苗情況如圖5所示,空白對(duì)照的出苗率達(dá)到 90%,而添加氯嘧磺隆的土壤明顯抑制小麥出苗率,出苗率僅 70%;投加 LCY-4于氯嘧磺隆污染土壤的處理組,出苗率達(dá)到85%,結(jié)果表明降解菌的加入有效減輕了氯嘧磺隆對(duì)小麥出苗率的抑制作用,由此可見,降解菌可有效緩解氯嘧磺隆對(duì)小麥種子發(fā)芽的毒害作用,具有一定的應(yīng)用潛能.

播種 15d后,小麥幼苗株高、根長(zhǎng)及鮮重如圖 6所示.氯嘧磺隆污染土壤中小麥幼苗株高、根長(zhǎng)及鮮重明顯低于未污染土壤生長(zhǎng)的小麥(P<0.05),表明氯嘧磺隆的殘留對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)有一定的抑制作用.投加降解菌LCY-4的氯嘧磺隆污染土壤中小麥株高、根長(zhǎng)及鮮重[分別為(28.25±2.72)cm、(7.48±0.17)cm、(0.25±0.01)g]明顯大于未加入降解菌的氯嘧磺隆污染土壤生長(zhǎng)的小麥株高、根長(zhǎng)及鮮重[分別為(23.20±1.74)cm、(6.42±0.10)cm、(0.19±0.02)g](P<0.05),說明施用降解菌LCY-4可降低氯嘧磺隆對(duì)小麥幼苗的藥害.結(jié)果表明,高效降解菌株 LCY-4對(duì)土壤中的氯嘧磺隆具有一定的降解,從而降低對(duì)小麥幼苗的藥害.

圖5 LCY-4 修復(fù)氯嘧磺隆污染土壤對(duì)盆栽小麥出苗率影響Fig.5 The effect of chlorimuron-ethyl-contained soil bioremediation by strain LCY-4 on wheat seedling emergence

圖6 LCY-4修復(fù)氯嘧磺隆污染土壤對(duì)小麥生長(zhǎng)狀況的影響Fig.6 The effect of chlorimuron-ethyl-contained soil bioremediation by strain LCY-4 on wheat seeding growth

氯嘧磺隆是一種超高效、長(zhǎng)殘留性除草劑,植株苗期是植物生長(zhǎng)的敏感階段,除草劑藥害首先會(huì)體現(xiàn)在植物生長(zhǎng)的敏感時(shí)期[21].本研究選取盆栽土培法種植對(duì)氯嘧磺隆比較敏感的農(nóng)作物小麥,考察降解菌的投加對(duì)氯嘧磺隆藥害的解除效果,以及對(duì)敏感作物的影響,為該降解菌在大田生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中提供參考.

應(yīng)用微生物降解土壤中污染物具有環(huán)保高效的優(yōu)點(diǎn),但微生物與土壤微環(huán)境的相互作用機(jī)制[22],高效降解菌在不同土壤條件下(如鹽堿地、巖性土等)降解能力以及適應(yīng)性,土壤微生物群落的改變以及微生物降解技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等仍有待進(jìn)一步探討.

3 結(jié)論

3.1 本研究以氯嘧磺隆為目標(biāo)污染物篩選獲得的 1株高效氯嘧磺隆降解酵母菌,經(jīng)菌株形態(tài)特征和26S rDNA序列分析,鑒定該菌株屬膠紅酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa),命名為L(zhǎng)CY-4.

3.2 利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株 LCY-4在含氯嘧磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中優(yōu)化降解條件為:接種量2.5%,培養(yǎng)溫度 28℃,pH 6.0,在含 100mg/L氯嘧磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5d后,降解率為87.33%.

3.3 菌株 LCY-4在氯嘧磺隆初始濃度為10mg/kg(干土)的土壤中,最佳降解條件為:接種量2.5%、溫度25℃、pH 6.0、土壤含水量30%,靜息培養(yǎng)30d后,氯嘧磺隆的降解率為90.74%.

3.4 當(dāng)土壤中氯嘧磺隆的濃度為 10mg/kg時(shí),投加降解菌LCY-4后,小麥的出苗率、株高、根長(zhǎng)及鮮重均明顯高于未投加降解菌的對(duì)照組(P<0.05).盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,施用降解菌 LCY-4可減輕氯嘧磺隆對(duì)小麥幼苗的藥害.

參考文獻(xiàn)：

[1]包 磊,謝 明,張艷軍,等.巨大芽胞桿菌 E-1菌株對(duì)土壤氯嘧磺隆殘留的降解效果 [J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2016,32(5):672-675.

[2]侍 南.氯嘧磺隆降解菌的分離鑒定、降解特性和機(jī)理及其修復(fù)效果 [D]. 杭州:浙江大學(xué), 2016.

[3]侯憲文,吳建軍,徐建明.鉛-芐嘧磺隆對(duì)土壤微生物活性與群落結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2007,27(6):738-742.

[4]趙衛(wèi)松.煙嘧磺隆和噻吩磺隆微生物降解研究 [D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[5]黃 星,何 健,潘繼杰,等.噻吩磺隆降解菌 FLX的分離鑒定及降解特性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2006,26(2):214-218.

[6]鄒月利,陶 波.磺酰脲類除草劑的降解機(jī)制及代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展 [J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2011,32(10):24-31.

[7]司友斌,岳永德,湯 鋒,等.磺酰脲類除草劑在硅膠 G 表面的光解 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2002,22(2):270-272.

[8]郭 敏,單正軍,石利利,等.三種磺酰脲類除草劑在土壤中的降解及吸附特性 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012,32(6):1459-1464.

[9]徐建民,汪海珍,謝正苗,等.甲磺隆結(jié)合殘留物在土壤結(jié)合態(tài)腐殖物質(zhì)中的分布 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2002,22(1):2-6.

[10]Zhang X L, Li X, Zhang C G, et al. Ecological risk of long- term chlorimuron- ethyl application to soil microbial community: an in situ investigation in a continuously cropped soybean field in Northeast China [J]. Environmental science and pollution research international, 2011,18(3):407-415.

[11]滕春紅,李曉薇,陶 波.氯嘧磺隆降解真菌的分離和鑒定 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,39(12):19-22.

[12]劉 艷,范麗薇,王曉萍.氯嘧磺隆降解菌的分離鑒定及其降解特性 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010,37(8):1164-1168.

[13]Al-Kharusi S, Abed R M, Dobretsov S. Changes in respiration activities and bacterial communities in a bioaugmented oil-polluted soil inresponse to the addition of acyl homoserine lactones [J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2016,107:165–173.

[14]Zhang X L, Li X, Zhang C G, et al. Responses of soil nitrogenfixing, ammonia- oxidizing, and denitrifying bacterial communities to long- term chlorimuron- ethyl stress in a continuously cropped soybean field in Northeast China [J].Annals of Microbiology, 2013,63(4):1619-1627.

[15]Yang L Q, Li X Y, Li X, et al. Bioremediation of chlorimuron-ethyl-contaminated soil by Hansschlegelia sp.strain CHL1 and the changes of indigenous microbial population and N-cycling function genes during the bioremediation process[J]. Journal of Hazardous Materials, 2014,274:314-321.

[16]汪佳秀,張祥輝,穆文輝,等.降解菌 2N3對(duì)被氯嘧磺隆污染土壤的生物修復(fù) [J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2010,12(1):49-53.

[17]Zhang H, Zhang X G, Mu W H, et al. Biodegradation of Chlorimuron-ethyl by the Bacterium Klebsiella jilinsis 2N3 [J].Journal of Environmental Science and Health Part B-Pesticides Food Contaminants and Agricultural Wastes, 2010,45(6):501-507.

[18]Li C Y, Zang H L, Yu Q, et al. Biodegradation of chlorimuronethyl and the associated degradation pathway by Rhodococcus sp.D310-1 [J]. Environmental Science and Pollution Research,2016,23(9):8794-8805.

[19]Tan H B, Xu M K, Li X Y, et al. Effects of chlorimuron-ethyl application with or without urea fertilization on soil ammoniaoxidizing bacteria and archaea [J]. Journal of Hazardous Materials, 2013,260:368-374.

[20]劉 輝,陶 波.土壤微生物對(duì)氯磺隆降解的研究 [J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù), 2003,23(1):36-39,55.

[21]Zang H L, Y Q, Lv T Y, et al. Insights into the degradation of chlorimuron-ethyl by Stenotrophomonas maltophilia D310-3 [J].Chemosphere, 2016,144:176-184.

[22]徐建民,黃昌勇,安 曼,等.磺酰脲類除草劑對(duì)土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2000,20(6):491-494.