新疆南疆規(guī)模羊場片形吸蟲的基因鑒定及分析

王 娜， 徐建平， 胡建軍， 崔 鑫， 張婉琪， 張瑩鈺， 徐 震

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)南疆動物疫病診斷與防控工程實(shí)驗室， 新疆 阿拉爾 843300 ；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站， 新疆 庫爾勒 841000 ；3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)

片形吸蟲病是由片形吸蟲感染引起的人獸共患病。 肝片吸蟲寄生于食草哺乳動物和人的肝臟和膽管內(nèi)，對肝臟造成機(jī)械性損傷，引起機(jī)體肝炎、膽管炎，導(dǎo)致全身中毒和營養(yǎng)障礙使機(jī)體發(fā)育不良甚至死亡的寄生蟲病。 片形吸蟲在我國有兩種：肝片形吸蟲(Fasciola hepatica) 和大片形吸蟲(F.gigantica)，屬于片形科(Fasciolidae)。 肝片形吸蟲呈世界性分布，在我國也是分布最廣泛、危害最嚴(yán)重的寄生蟲病之一，遍及全國31 個省市自治區(qū)，很多呈地區(qū)性流行；大片吸蟲主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國多見于南方諸省、區(qū)[1]。 片形吸蟲在其慢性病程中使動物瘦弱，發(fā)育障礙，乳牛產(chǎn)奶量減少，毛、肉產(chǎn)量減少和質(zhì)量下降，給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。 人感染片形吸蟲可引起腹痛、發(fā)熱和黃疸等癥狀，嚴(yán)重者甚至危及生命。

傳統(tǒng)的分類學(xué)主要依據(jù)片形吸蟲成蟲的形態(tài)，結(jié)合生活史、流行病學(xué)等特征對蟲體進(jìn)行分類鑒定，對于形態(tài)比較規(guī)則的蟲體鑒別比較有效。 而兩種片形吸蟲形態(tài)極其相似，且片形吸蟲種內(nèi)個體差異較大，同一蟲種又因宿主的種類、宿主的反應(yīng)的不同而不同，導(dǎo)致蟲體的形態(tài)極其不規(guī)則，這就使得利用傳統(tǒng)的分類學(xué)方法對識別一些親緣種及隱藏種有一些難度。 本研究以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合PCR 鑒定方法，從分子生物學(xué)分類角度來鑒定在形態(tài)上較難分辨其種類的片形吸蟲，為新疆片形吸蟲種類鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2017 年春季，新疆南疆某規(guī)模化羊場羊群中出現(xiàn)部分羊逐漸消瘦，食欲減退，被毛粗亂、易脫落，黏膜蒼白。 該養(yǎng)殖場為舍飼管理，小尾寒羊與當(dāng)?shù)仄贩N羊雜交繁殖方式。 經(jīng)對3 只極度消瘦的羊只剖檢，肝臟表面發(fā)現(xiàn)有蟲體，肝組織受損，肝臟腫大，膽管增粗。 剝離肝臟中蟲體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(OMEGA Biotek Inc，Norcross，USA)、2 ×Taq PCR Master-Mix、DNA 凝膠回收試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 儀器 PCR 儀(TECHNE，TC -1500)，小型高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5415R，Eppendorf 公司)；電泳儀(Thermal cycler Block，Thermo Fisher 公司)；凝集成像儀(Gel DocTM XR+，Bio-RAD 公司)。

1.4 參考株 文章中涉及的肝片形吸蟲、大片形吸蟲、中間型吸蟲的參考株均下載于NCBI 中Gen-Bank。

1.5 方法

1.5.1 片形吸蟲處理及DNA 提取 取保存的完整蟲體，PBS 反復(fù)沖洗，研磨、凍融并提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 引物 根據(jù)GenBank 參考序列，選取片形吸蟲第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(First internal transcribed spacer， ITS-1)和第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(second internal transcribed spacer， ITS-2)基因的特異性引物作為肝片形吸蟲基因分型的PCR 擴(kuò)增引物[2]，2 對引物如下：ITS-1(forward：5′ -CCGTAGCCCAAATC -T-3′)和(reverse：5′-TGACTACCCCACGGA -3′)；ITS - 2(forward：5′ - ATGCACCCGGTCCT - 3′)和(reverse：5′-CATGACTTACCGAAC -3′)，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.3 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系 ITS-1 引物的PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：2 ×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物ITS - 1F/ITS - 1R 各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL 混勻。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；ITS -2 引物的PCR 體系(50 μL)：2 ×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物ITS- 2F/ITS - 2R 各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O18 μL 混勻。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.4 PCR 產(chǎn)物純化回收 取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒純化回收PCR 產(chǎn)物。 送北京金諾銳杰基因科技有限公司測序。

2. 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征 解剖鏡下觀察，片形吸蟲背腹呈扁平，外觀呈樹葉狀，蟲體前端有一呈三角形的錐狀突，后端鈍圓，體表有小的皮棘。 口吸盤呈圓形，位于錐狀突前端。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 以片形吸蟲ITS -1 引物、ITS-2 引物，經(jīng)PCR 分別擴(kuò)增出約360 bp、250 bp 大小的目的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖1)。

圖1 肝片形吸蟲PCR 鑒定

2.3 基因序列分析 以ITS-1 引物擴(kuò)增的ITS-1 基因序列，測序后在NCBI 中BLAST 比對，顯示新疆南疆3 例片形吸蟲ITS-1 基因序列與大片吸蟲參考株ISEM V-966(法屬圭亞那/2004，負(fù)鼠，AJ628403.1)和FgGZB2(中國/2004，牛，AJ628425.1)核苷酸同源性達(dá)98.2%；與肝片形吸蟲參考株FhGSG2(中國甘肅/2004，山羊，AJ628431.1)和FhNJG3(中國江蘇/2004，山羊，AJ628432.1)核苷酸同源性達(dá)100%；與中間型吸 蟲 參 考 株 FgGZB3 (中 國 貴 州/2004， 牛，AJ628426.1)、 FhSCC19 ( 中 國 四 川/2004， 牛，AJ628427.1)、 FhHLJC4 (中 國 黑 龍 江/2004， 牛，AJ628428.1)、 FhNJG4 (中 國 江 蘇/2004， 山 羊，AJ628429.1)、 FhGSG3 (中 國 甘 肅/2004， 山 羊，AJ628430.1)核苷酸同源性達(dá)98.2%(圖2)。

圖2 片形吸蟲ITS-1 基因核苷酸同源性比較

圖3 ITS-1 基因序列構(gòu)建的片形吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

以ITS-2 引物擴(kuò)增的3 例新疆南疆片形吸蟲ITS-2 基因序列與大片吸蟲參考株FgC3(伊朗/2011，牛， JF432073.1)、 Shillong (印 度/2014， 羊，KJ720002.1)核苷酸同源性分別達(dá)98.7%和98.4%；與肝片吸蟲參考株FhF4(中國云南/2011，奶牛，JF496717.1)、FhGZ(廣州/2016，人，KU555843.1)核苷酸同源性達(dá)99.7%；與中間型吸蟲參考株Khanh.Ct.1(越南/2009，牛，AB536917.1)、C -Bf104(埃及/2008，狷羚羊，AB553738.1)、FhHLJC10(中國/2011，JF708041.1)、Itanagar(印度/2014，人，KU720005.1)核苷酸同源性均達(dá)98.7%(圖4)。

圖4 片形吸蟲ITS-2 基因核苷酸同源性比較

圖5 ITS-2 基因序列構(gòu)建的片形吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

新疆是我國5 大牧區(qū)之一，放牧羊寄生蟲病種類繁多，其中消化道寄生蟲對羊的危害嚴(yán)重，導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降，飼料利用率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降，嚴(yán)重困擾新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。 新疆部分地區(qū)吸蟲感染情況較為嚴(yán)重，井波等2008 年在新疆庫車縣開展的牛羊寄生蟲感染調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牛肝片形吸蟲感染率為24.38%，大片形吸蟲感染率為35.74%；羊肝片形吸蟲感染率為76.04%[3]。

目前普遍認(rèn)為自然界可能存在3 種不同的種類：肝片形吸蟲、大片形吸蟲和介于二者之間的“中間型”。 歐洲、美洲、澳洲地區(qū)只存在肝片形吸蟲，而非洲和亞洲地區(qū)存在肝片形吸蟲和大片形吸蟲[4]。 因此，多年來，非洲和亞洲地區(qū)片形吸蟲的種類鑒定一直存在很多爭議[5]。 有學(xué)者認(rèn)為除了有肝片形吸蟲和大片形吸蟲外，還可能存在片形吸蟲的“中間型”[6-7]。 黃維義(2002 年)等[8]鑒定出我國黑龍江的片形吸蟲有基因雜和型，認(rèn)為是“中間型”的片形吸蟲。

一些學(xué)者研究表明，ITS -1 序列可作為線蟲、吸蟲、原蟲、昆蟲等寄生蟲分類鑒定的遺傳標(biāo)記。核糖體DNA 的ITS -1 基因、ITS -2 基因作為片形吸蟲種類鑒定的遺傳標(biāo)記，其進(jìn)化速度比較快，用于低級分類階元或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢[2]。 董世娟(2004)[9]建立的特異PCR 方法，初步認(rèn)為ITS-1 序列可作為遺傳標(biāo)記來區(qū)分大片形吸蟲和肝片形吸蟲，同時也證實(shí)在我國除了此兩種片形吸蟲外，還可能存在著“中間型”的片形吸蟲。

本試驗通過片形吸蟲ITS -1 基因核苷酸同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)新疆南疆3 例片形吸蟲ITS -1 基因型與大片形吸蟲核苷酸同源性為98.2%，與肝片形吸蟲核苷酸同源性為100%，與中間型吸蟲核苷酸同源性為98.2%；ITS-2 基因型與大片形吸蟲核苷酸同源性為98.7%，與肝片形吸蟲核苷酸同源性為99.7%，與中間型吸蟲核苷酸同源性為98.7%。通過ITS-1 基因、ITS -2 基因核苷酸同源性比較、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析說明，本研究中的新疆南疆3 例片形吸蟲為肝片形吸蟲，證實(shí)新疆南疆某羊場存在肝片形吸蟲的感染。 在感染時間、地理分布等方面，新疆南疆某羊場感染的肝片形吸蟲與參考株FhGSG2(中國甘肅/2004，山羊，AJ628431.1)、Fh-NJG3(中國江蘇/2004，山羊，AJ628432.1)、FhF4(中國云南/2011，奶牛，JF496717.1)、FhGZ(中國廣州/2016，人，KU555843.1)相比較，它們都具有相同的遺傳進(jìn)化起源。

本試驗采用分子生物學(xué)技術(shù)，特異性ITS -1 和ITS-2 基因序列引物進(jìn)行鑒定片形吸蟲，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與靈敏、特異的的基因分類相結(jié)合，在一定程度上克服了形態(tài)學(xué)鑒定的局限性和主觀性，為新疆的片形吸蟲種類鑒定提供了科學(xué)的參考依據(jù)。