加米霉素注射液無菌檢查方法的試驗(yàn)

趙梅仙， 宋 敏， 張國棟， 張傳良， 徐金雷， 葛辛玫， 馬佳穎， 王 楠

(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司， 北京 海淀 100095)

加米霉素為氮雜內(nèi)酯類的第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由梅里亞有限公司開發(fā)的獸用抗生素加米霉素注射液ZACTRAN，分別于2007 年、2010 年、2011 年，經(jīng)由歐盟、加拿大和FDA 批準(zhǔn)使用，對(duì)溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等病原體有很好的抑菌和殺菌作用，臨床可用于預(yù)防和治療由以上病原菌引起的牛呼吸道感染的疾病(BRD)[1-6]。 可以用于動(dòng)物，具有吸收快、體內(nèi)殘留低、體內(nèi)分部廣、安全高效等優(yōu)點(diǎn)，暫無不良反應(yīng)報(bào)道。 為了保證藥品的質(zhì)量和用藥安全，必須進(jìn)行無菌控制。 本文根據(jù)《中國獸藥典》2015 年版一部附錄[7]、檢驗(yàn)操作規(guī)程[8]、相關(guān)文獻(xiàn)[9-12]對(duì)加米霉素注射液的無菌檢查進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，建立了可靠的無菌檢查方法并進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 供試品 加米霉素注射液為中牧實(shí)業(yè)股份有限公司自制(批號(hào)：130307、130319、130403)，規(guī)格為100 mL。

1.1.2 試劑 聚山梨酯80，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨，購自北京雅客生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京雅客生物科技有限公司。

1.1.4 稀釋劑與沖洗液 0.1% 無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液為自配，滅菌后備用。

1.1.5 菌種 大腸埃希菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、銅綠假單胞菌CMCC(B)10104、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98 001、黑曲霉CMCC(F)98003，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 儀器 HTY-2000A 集菌儀、全封閉無菌試驗(yàn)過濾培養(yǎng)器(杭州高得泰林生物設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 菌液制備

(1)取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨培養(yǎng)基1 mL，以0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍稀釋至10-6～10-9約為10 ～100 CFU/mL 備用。

(2)取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 的生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基1 mL，以0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍梯度稀釋至10-7備用。

(3)取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)24 h 的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，以0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍梯度稀釋至10-5～10-7約為10 ～100 CFU/mL 備用。

(4)接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d 的黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加3 ～5 mL 含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，以0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍梯度稀釋至10-5～10-7孢子數(shù)約為10 ～100 CFU/mL 的孢子懸液做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2 菌液計(jì)數(shù) 取上述菌液，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌液各1 mL加入培養(yǎng)皿，每種菌液做2 個(gè)平皿，注入胰酪大豆胨培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)24 ～48 h；生孢梭菌1 mL 加入培養(yǎng)皿，菌液做2 個(gè)平皿，注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)24 ～48 h；取黑曲霉菌和白色念珠菌液各1 mL 加入培養(yǎng)皿，每種菌液做2 個(gè)平皿，注入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)48 ～72 h。 計(jì)數(shù)，取平均值。

2.3 培養(yǎng)基的靈敏度和無菌檢查

2.3.1 培養(yǎng)基的無菌檢查 取121 ℃、滅菌15 min的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(12 mL/管)5 支，35 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，取121 ℃、滅菌15 min 的胰酪大豆胨培養(yǎng)基(9 mL/管)5 支，25 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。 試驗(yàn)結(jié)果為無菌生長，表明培養(yǎng)基無菌性檢查合格。

2.3.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查 取121 ℃、滅菌15 min的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(12 mL/管)7 支，分別接種小于100 CFU 的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2 支，另一支不接種作為空白對(duì)照，35 ℃恒溫培養(yǎng)3 d；取121 ℃、滅菌15 min的胰酪大豆胨培養(yǎng)基(9 mL/管)7 支，分別接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉各2 支，另一支不接種作為空白對(duì)照，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

2.4 方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 沖洗量的確定 取本品適量，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進(jìn)行稀釋，通過孔徑為0.45 μm 已被沖洗劑濕潤過的一次性全封閉集菌過濾培養(yǎng)器，分別用沖洗液300、500、700 mL 依次振搖沖洗，即每次100 mL，分別沖洗3 次、5 次、7 次，最后1 次沖洗液中加入相應(yīng)的試驗(yàn)菌，同法過濾，再加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL，作為供試品管。 另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為菌液對(duì)照管。

另取1 次性全封閉集菌過濾培養(yǎng)器過濾0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液后，分別只加入100 mL 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨培養(yǎng)基，不加對(duì)照菌液，作為該次試驗(yàn)的陰性對(duì)照管。置相應(yīng)溫度培養(yǎng)3 ～5 d。

2.4.2 檢查方法驗(yàn)證 取本品適量，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進(jìn)行稀釋，通過孔徑為0.45 μm 的已被沖洗劑濕潤過1 次性全封閉集菌培養(yǎng)器用沖洗液500 mL，分次振搖沖洗(每次100 mL)， 在最后1 次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，過濾。 加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨培養(yǎng)基100 mL，作為供試品管。 另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為陽性對(duì)照。 取試驗(yàn)用薄膜過濾器，一濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 mL，另一濾筒加入胰酪大豆胨培養(yǎng)基100 mL，分別作為相應(yīng)的陰性對(duì)照。 分別置于30 ℃～35 ℃、20 ℃～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。逐日觀察結(jié)果。

2.5 供試品無菌檢查 取本品10 瓶，每瓶取10 mL，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進(jìn)行稀釋，采用驗(yàn)證過的無菌檢查方法對(duì)3 批加米霉素注射液進(jìn)行無菌檢查，采用金黃色葡萄球菌作為陽性對(duì)照菌，取試驗(yàn)用薄膜過濾器，一濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 mL，另一濾筒加入胰酪大豆胨培養(yǎng)基100 mL，分別作為相應(yīng)的陰性對(duì)照，細(xì)菌培養(yǎng)30 ℃～35 ℃培養(yǎng)14 d，霉菌培養(yǎng)20 ℃～25 ℃培養(yǎng)14 d。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌液計(jì)數(shù) 7 種菌液菌落的計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。由表1 可知，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液稀釋到一定的濃度，菌落計(jì)數(shù)能達(dá)10 ～100 CFU/mL，符合要求，能作為試驗(yàn)菌液。

表1 各驗(yàn)證用菌液的稀釋度及菌落數(shù)

3.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查 培養(yǎng)基靈敏度檢查見表2， 由表2 可知，各試驗(yàn)菌株在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨培養(yǎng)基中，經(jīng)過特定的時(shí)間培養(yǎng)均生長良好，空白對(duì)照管無菌生長，表明該培養(yǎng)基對(duì)各試驗(yàn)菌株的生長沒有影響，其靈敏度符合要求。

3.3 沖洗量的確定 逐日觀察結(jié)果，結(jié)果見表3。從表3 中可知，當(dāng)沖洗量為300 mL 時(shí)，除加入金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的供試品管外，其余5 種菌在規(guī)定的條件下，供試品管與菌液對(duì)照管比較，均生長良好，說明該檢驗(yàn)量的供試品在該檢驗(yàn)條件下對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑菌作用，需要增加沖洗液的用量，去除抑菌成分。

表2 培養(yǎng)基靈敏度檢查試驗(yàn)結(jié)果

表3 沖洗量驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)沖洗量增加至500 mL 時(shí)，供試品管中各菌生長良好。 兩個(gè)陰性對(duì)照管均無微生物生長，兩種培養(yǎng)基均澄清透明。 因此確定本品的最佳沖洗量細(xì)菌檢查和真菌檢查均為500 mL。

3.4 檢查方法驗(yàn)證結(jié)果 無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果見表4，由表4 可知，供試品各容器中試驗(yàn)菌均生長良好，證明了供試品的該檢驗(yàn)量在該試驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。

表4 檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

3.5 供試品無菌檢查 供試品的無菌檢查選擇金黃色葡萄球菌作為陽性對(duì)照菌進(jìn)行檢驗(yàn)，其檢驗(yàn)結(jié)果見表5。 從表5 可見，陽性對(duì)照菌72 h 內(nèi)生長正常，陰性對(duì)照管、各供試品管無菌生長。

表5 供試品無菌檢查結(jié)果

4 討論

按《中國獸藥典》規(guī)定的無菌檢查法對(duì)加米霉素注射液進(jìn)行了無菌方法研究，試驗(yàn)選用薄膜過濾法，選擇金黃色葡萄球菌作陽性對(duì)照菌。 研究結(jié)果表明，加米霉素注射液在試驗(yàn)菌液計(jì)數(shù)及所用培養(yǎng)基無菌性、靈敏度符合規(guī)定條件下，經(jīng)沖洗量為500 mL后，該產(chǎn)品無抑菌和干擾作用。 三批樣品經(jīng)檢查，符合無菌要求。 因此，確定加米霉素注射液的無菌檢查方法為：取本品10 瓶，每瓶取10 mL，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進(jìn)行稀釋，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液分次沖洗(每膜不少于500 mL)，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。通過上述驗(yàn)證所建立的方法可用于加米霉素注射液的無菌檢查，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，同時(shí)，本試驗(yàn)建立的無菌檢查方法對(duì)于同類注射液的無菌檢查有一定的指導(dǎo)意義。