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    犬干擾素α2的原核表達(dá)及抗病毒活性分析

    2018-04-25 03:16:44姚凌云王晶宇歐陽偉吳世妍夏興霞諸玉梅王曉麗潘群興芮榮王永山
    關(guān)鍵詞:復(fù)性干擾素抗病毒

    姚凌云,王晶宇,歐陽偉,錢 晶,吳世妍,夏興霞,諸玉梅,王曉麗,潘群興,芮榮,王永山

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210014)

    近年來,養(yǎng)犬業(yè)發(fā)展快速,犬的傳染病和非傳染病的發(fā)病率也在逐年升高,嚴(yán)重威脅著養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前,犬病的研究比較滯后,生物防治性制劑缺乏,遠(yuǎn)不能滿足對犬病防治的實(shí)際需求。而犬類感染病毒后,通常采用注射干擾素并輔助特異性單克隆抗體的治療手段,以控制病情惡化進(jìn)而轉(zhuǎn)歸康復(fù)。因此,犬干擾素具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

    干擾素是機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染或其他生物誘導(dǎo)劑的刺激而產(chǎn)生的一類具有抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能的活性蛋白質(zhì)[2,3]。根據(jù)干擾素氨基酸序列和其特異性識別受體的不同,主要分為3種:IFN-α、IFN-β和IFN-γ[4]。IFN-α和IFN-β屬I型干擾素,能在幾分鐘之內(nèi)激活細(xì)胞并建立抗病毒狀態(tài),其中IFN-α主要來源于白細(xì)胞,因其具有廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。犬干擾素α(Canine Interferon-α,CaIFN-α)基因全長為564個(gè)核苷酸,編碼187個(gè)氨基酸(包含23個(gè)氨基酸的信號肽),CaIFN-α存在8個(gè)亞型[5],其同源性達(dá)93%~100%。

    天然干擾素制備工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高,而利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白的方法具有操作簡單、成本低廉和可控性好等優(yōu)勢,已成為當(dāng)前重組蛋白制備的主要手段。根據(jù)外源基因表達(dá)宿主的不同,表達(dá)系統(tǒng)可大致分為:大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[6]。其中,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的蛋白表達(dá)水平高、具備可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢,已被廣泛地用于外源蛋白的制備[7]。

    CaIFN-α的各亞型之間的抗病毒活性存在差異。目前,有關(guān)CaIFN-α2的研究較少,因此,本試驗(yàn)通過人工合成CaIFN-α2成熟活性區(qū)序列(去除信號肽),利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組CaIFN-α2,并探討了CaIFN-α2的抗病毒活性,為研制新型高效的犬用干擾素奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、載體、病毒及細(xì)胞E. coliDH5α、E. coliRosetta、原核表達(dá)載體pET-28a(+)、水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)和犬腎細(xì)胞(madindarby canine kidney,MDCK)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III、T4 DNA連接酶和rTaqmix均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA Marker和蛋白Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司;小牛血清購自浙江航天生物有限公司;增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;HisTrap HP蛋白純化系統(tǒng)購自GE公司;硝酸纖維素(NC)膜購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;鼠抗His單克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG由本實(shí)驗(yàn)室自制;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 CaIFN-α2基因的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已公布的CaIFN-α2序列(GenBank登錄號:M28625.1),去除信號肽,并在目的基因前、后端引入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)。合成的目的基因序列連在pUC57-simple載體上,重組獲得的陽性質(zhì)粒命名為pUC57-CaIFN-α2。

    1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pUC57-CaIFN-α2和表達(dá)載體分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III雙酶切消化后,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果;回收目的基因與載體pET-28a(+)片段,在16℃條件下連接過夜,次日轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,涂于固體瓊脂平板上(100 μg/mL Kan+),37℃培養(yǎng)12~16 h;挑取單個(gè)菌落接種于3 mL的LB液體培養(yǎng)基中(100 μg/mL Kan+),提取質(zhì)粒,采用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定;最后,將鑒定正確的陽性質(zhì)粒送公司測序,命名為pET-28a-CaIFN-α2。

    1.5 CaIFN-α2基因的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將重組質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)中,涂布在含卡那霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)平皿上,放37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16 h。挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng),按1∶100比例轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體,用10 mL PBS重懸,冰浴超聲破碎后,離心收集上清和沉淀;分別用全菌、破碎上清及沉淀制備樣品,同時(shí)設(shè)pET-28a(+)空載體菌及未轉(zhuǎn)化菌作對照,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,電泳結(jié)果用BandScan 5.0軟件分析目的蛋白的表達(dá)量。Western blot鑒定,一抗為鼠抗His單克隆抗體(1∶2000稀釋);二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1000稀釋),DAB溶液顯色。將鑒定正確的工程菌命名為pET-28a-CaIFN-α2/Rosetta。

    1.6 CaIFN-α2表達(dá)條件的優(yōu)化 取重組工程菌液pET-28a-CaIFN-α2/Rosetta按1%的量接入LB液體培養(yǎng)基中(100 μg/mL Kan+),37℃ 220 r/min振搖培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,分別誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h、5 h和6 h,并同時(shí)設(shè)立空載體誘導(dǎo)表達(dá)的對照組。采用SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物,利用BandScan 5.0軟件分析各個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的表達(dá)量,表達(dá)產(chǎn)物命名為CaIFN-α。

    1.7 重組CaIFN-α2的純化 將CaIFN-α2包涵體粗制品(200 mL培養(yǎng)體積)中加入10 mL預(yù)冷7M鹽酸胍,4℃攪拌2~3 h,10 000×g離心10 min,收集上清;將上清加入10倍體積的0.15 mol/L硼酸緩沖液使其緩慢復(fù)性,隨后裝入透析袋中,置于10 mmol/L氯化銨中透析24 h,間隔8 h換液一次;透析后離心收集上清,加入硫酸銨使其達(dá)到80%飽和度,緩慢攪拌8 h,離心收集沉淀;沉淀用8 mL去離子水溶解,再次放入透析袋中用去離子水透析24 h,中間換液2次;透析結(jié)束后用0.1 N的鹽酸調(diào)pH至2.0,再放入pH 7.2 20 mmol/L PBS中透析24 h,中間換液1次。10 000×g離心10 min收集上清,即為粗制品CaIFN-α2。將上述復(fù)性液上載1 mL HisTraqTMHP親和層析柱:用5個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L氯化鈉、20 mmol/L咪唑,pH 7.4)平衡柱子;加復(fù)入性液;上載完樣品后,用5個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液洗滌柱子,再用5個(gè)柱體積洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L氯化鈉、500 mmol/L咪唑,pH 7.4)進(jìn)行一步洗脫,收集流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

    1.8 重組CaIFN-α2的活性測定 采用MDCK/VSV微量細(xì)胞病變抑制法檢測純化后重組CaIFN-α2的抗病毒活性:將生長狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞接種于96孔板,待細(xì)胞長成單層后,加入用含5%血清的DMEM培養(yǎng)液10倍倍比稀釋的純化后重組CaIFN-α2,每孔加入100 μL稀釋樣品,置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔接種100 μL 100個(gè)TCID50的VSV,置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;同時(shí)設(shè)病毒對照(只加病毒,不加重組CaIFN-α2)和空白對照(不加病毒和重組CaIFN-α2);在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變,以抑制50%細(xì)胞病變的最高CaIFN-α2稀釋度作為一個(gè)活性單位,根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算重組CaIFN-α2的抗病毒活性。

    2 結(jié)果

    2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2進(jìn)行雙酶切鑒定,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示,可見兩條帶,分別約為5200 bp與510 bp,與預(yù)期大小相符,見圖1。測序結(jié)果也表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2構(gòu)建成功。

    圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 1 Identi fi cation of the recombinant plasmid pET-28a-CaIFN-α2 digested with EcoR I and Hind III

    2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析與Western blot鑒定工程菌pET-28a-CaIFN-α2/Rosetta經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物,通過SDS-PAGE分析,可見在相對分子質(zhì)量約23 kDa處有一明顯條帶,與重組CaIFN-α2大小一致,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在;利用BandScan 5.0軟件分析,目的蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的表達(dá)量的52.5%,見圖2。Western blot檢測結(jié)果可見約23 kDa的條帶,與理論值相符,表明重組CaIFN-α2獲得成功表達(dá)。

    圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析Fig. 2 SDS-PAGE and Western blot analysis of the expressed products

    2.3 表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化及純化 在同種宿主菌中,含CaIFN-α2的重組E.coliRosetta經(jīng)1 mmol/L的IPTG依次誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h、5 h和6 h后,重組CaIFN-α2的表達(dá)量分別為40.5%、46.6%、52.5%、45.3%和41.8%,在誘導(dǎo)表達(dá)4 h時(shí)最高,因此本試驗(yàn)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為4 h,見圖3。以試驗(yàn)優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為條件,擴(kuò)大培養(yǎng)工程菌,提取的包涵體經(jīng)變性、復(fù)性和親和層析純化后,重組CaIFN-α2的純度可達(dá)92%。

    2.4 重組CaIFN-α2的抗病毒活性分析 采用MDCK/VSV系統(tǒng)微量細(xì)胞病變抑制法檢測純化后的重組CaIFN-α2的抗病毒活性,結(jié)果顯示重組CaIFN-α2在MDCK細(xì)胞上呈現(xiàn)較高的抗病毒活性,見圖4,經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算,活性為3.16×106U/mL。

    3 討論

    圖3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization result of induction time

    圖4 重組CaIFN-α2的抗病毒活性分析Fig. 4 Antiviral activity analysis of the recombinant CaIFN-α2 in MDCK cells

    近年來,隨著我國養(yǎng)犬業(yè)的迅速發(fā)展,犬的品種和數(shù)量也逐漸增多;與此同時(shí),犬的各種病毒性疾病問題也日益凸顯。CaIFN-α具有廣譜的抗病毒活性,在犬病毒性疾病的臨床治療過程中起到重要的作用。林德貴[8]使用重組CaIFN-α治療犬瘟熱,結(jié)果表明重組CaIFN-α具有明顯的臨床療效。蘇建東[9]驗(yàn)證了重組CaIFN-α對犬細(xì)小病毒病的治療效果穩(wěn)定。除此之外,CaIFN-α還具有免疫調(diào)節(jié)功能。鄒勇等[10]研究發(fā)現(xiàn),一定劑量的干擾素α可明顯提高狂犬病疫苗的免疫效果,減少免疫接種的副反應(yīng)。因此,CaIFN-α具有良好的臨床應(yīng)用前景。

    目前,CaIFN-α各亞型已成功克隆并表達(dá)。Taira等[5]將CaIFN-α的8個(gè)亞型分為2組,其中CaIFN-α1、CaIFN-α2和CaIFN-α7為一組;CaIFN-α3~CaIFN-α6和CaIFN-α8為一組;通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組CaIFN-α7,在犬腎細(xì)胞上抗水皰性口炎病毒的活性為2.0×107U/mg。徐曉娟等[11]通過對CaIFN-α1基因的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá),表達(dá)的重組蛋白經(jīng)復(fù)性后的抗病毒活性為2×106U/mL。第一組中的CaIFN-α2雖然早已克隆出來,但至今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其生物學(xué)活性和功能。本研究制備的CaIFN-α2在MDCK上的抗病毒活性為3.16×106U/mL,這與Taira等[5]報(bào)道的第一組亞型CaIFN-α具有較高抗病毒活性結(jié)果是一致的。

    在表達(dá)系統(tǒng)的選擇上,由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)迅速、產(chǎn)量高,便于規(guī)模化操作等優(yōu)勢[12],且已有很多通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出抗病毒活性較高的動(dòng)物干擾素的報(bào)道[13,14]。因此本試驗(yàn)應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CaIFN-α2,表達(dá)的重組CaIFN-α2主要以包涵體的形式存在,表達(dá)量占菌體總蛋白的比例高達(dá)52.5%。對包涵體蛋白而言,復(fù)性獲得具有生物學(xué)活性的蛋白是一個(gè)重要且關(guān)鍵的步驟,目前蛋白的復(fù)性方法主要有透析復(fù)性法、稀釋復(fù)性法、層析復(fù)性法和高流體靜壓復(fù)性法等[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道稱,透析復(fù)性法對蛋白復(fù)性液中的化學(xué)環(huán)境起到穩(wěn)定的作用,而稀釋復(fù)性法則能極大地降低復(fù)性過程中蛋白的損失[16]。本試驗(yàn)采用稀釋復(fù)性和透析復(fù)性相結(jié)合的方法對CaIFN-α2重組蛋白進(jìn)行復(fù)性,可去除其中大部分雜蛋白,有利于提高重組蛋白的純度和增加目的蛋白的回收效率。

    綜上所述,本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a-CaIFN-α2,在大腸桿菌Rosetta中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),表達(dá)量為52.5%,并建立了一套系統(tǒng)穩(wěn)定、操作簡單的變復(fù)性方法,獲得的重組CaIFN-α2的抗病毒活性可達(dá)3.16×106U/mL,為進(jìn)一步研究CaIFN-α2的分子生物學(xué)特性和功能及其臨床生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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