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    非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

    2018-04-25 03:16:48王西西吳映彤郭曉宇李金祥
    關(guān)鍵詞:傳代活疫苗毒株

    王西西,陳 青,吳映彤,郭曉宇,李金祥

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 北京 100193;2.北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方) 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京102206;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,北京 100081)

    非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一種核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒,在病毒分類(lèi)中隸屬于DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬,為該科唯一成員,且是目前唯一已知的蟲(chóng)媒DNA病毒[1]。ASFV病毒粒子具有雙層囊膜結(jié)構(gòu),基因組為線性雙鏈DNA分子,不同毒株之間基因組大小存在一定差異,總體介于170~190 kb之間;ASFV基因組可編碼150多個(gè)開(kāi)放閱讀框,成熟病毒粒子中含有50種以上結(jié)構(gòu)蛋白[2]。ASFV主要通過(guò)巨胞飲以及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用感染宿主單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)[3,4],根據(jù)毒力的不同可將其分為高致病性、中等毒力、低毒力以及感染無(wú)臨床癥狀毒株等。非洲豬瘟(african swine fever,ASF)臨床病例中以高致病性病毒感染最為常見(jiàn),其發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[5,6]。因此,OIE將ASF列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病,我國(guó)也將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。

    20世紀(jì)中前期,ASF主要在非洲大陸豬群中傳播,1957年之后傳入歐洲多個(gè)國(guó)家,包括葡萄牙、西班牙、意大利和法國(guó)等,給上述國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。到20世紀(jì)90年代中期,除了仍在意大利的撒丁島流行,ASF已從歐洲消除[5,6]。2007年,ASF在高加索地區(qū)和俄羅斯暴發(fā)并持續(xù)流行,疫情延至東歐多國(guó),再次突顯了ASF對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)的巨大威脅。由于ASFV強(qiáng)毒株基因組可編碼多種蛋白質(zhì),用以干擾宿主的天然免疫系統(tǒng),從而抑制和逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng),為自身的增殖、擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件,使得ASF至今尚無(wú)有效疫苗用于防治,因此疫苗的研發(fā)對(duì)控制該病具有重大意義。針對(duì)ASFV疫苗的研究始于上世紀(jì)60年代,由于ASFV擁有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制,為疫苗研發(fā)工作帶來(lái)諸多困難。

    隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和疫苗學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,以及對(duì)病毒與宿主免疫系統(tǒng)互作機(jī)制的深入研究,ASF疫苗研制取得了較大進(jìn)展。本文對(duì)主要的ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗以及基因工程亞單位疫苗等研究進(jìn)展進(jìn)行概述,以期為ASF疫苗開(kāi)發(fā)提供參考。

    1 滅活疫苗

    傳統(tǒng)病毒疫苗可通過(guò)病毒滅活和病毒致弱兩種方法進(jìn)行制備。滅活疫苗通過(guò)物理或化學(xué)手段將病原滅活,使其失去感染能力,但保留其抗原性。迄今為止,采用多種傳統(tǒng)方法制備的ASF滅活疫苗均不能對(duì)強(qiáng)毒攻擊提供有效的免疫保護(hù)[7,8],包括病毒接種肺泡巨噬細(xì)胞以及感染脾組織后勻漿制備的滅活疫苗。雖然用ASF滅活疫苗免疫后可產(chǎn)生高效價(jià)的抗體,但很難檢測(cè)到中和抗體的存在。Blome等[9]研究表明,即使用新型佐劑PolygenTM或Emulsigen(?)-D等與ASFV滅活抗原進(jìn)行配伍,免疫動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV特異性抗體,但仍未能提高疫苗的免疫保護(hù)效力。這可能是由于產(chǎn)生的ASFV特異性抗體并不具有中和活性,提示細(xì)胞免疫在ASF疫苗免疫保護(hù)中起重要作用。此外,Gómez-Puertas等[10]研究人員也證實(shí)在細(xì)胞傳代過(guò)程中,低代次和高代次的ASFV毒株對(duì)中和抗體的敏感性存在差異。鑒于現(xiàn)有研究結(jié)果,采用傳統(tǒng)方法研制有效的ASF滅活疫苗困難很大。

    2 減毒活疫苗

    根據(jù)減毒活疫苗毒株來(lái)源不同,可將ASF減毒活疫苗毒株分為三類(lèi):傳代致弱毒株、天然致弱毒株和重組致弱毒株。減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈持久的免疫應(yīng)答,但生物安全是其使用的主要限制因素。采用分子生物學(xué)手段,可通過(guò)基因重組、靶向缺失以及一次性侵染技術(shù)來(lái)增強(qiáng)減毒活疫苗的安全性。

    2.1 傳代致弱毒株 ASFV可經(jīng)過(guò)豬骨髓來(lái)源細(xì)胞、Vero和COS-1等細(xì)胞系傳代致弱。傳代過(guò)程中,ASFV致病力逐漸下降,同時(shí)病毒免疫原性和穩(wěn)定性也隨之下降。在西班牙和葡萄牙,使用傳代致弱毒株免疫動(dòng)物后產(chǎn)生了災(zāi)難性的后果,免疫動(dòng)物呈現(xiàn)出肺炎、流產(chǎn)和死亡等副作用,在田間多次感染和異源強(qiáng)毒株存在的條件下,許多免疫動(dòng)物呈現(xiàn)ASF慢性感染臨床癥狀。因此,傳代致弱毒株的致病性導(dǎo)致此類(lèi)疫苗的開(kāi)發(fā)一度受阻。Krug等[11]利用分離株ASFV-G在Vero細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng),隨著傳代次數(shù)的增加,ASFV-G在Vero細(xì)胞中的復(fù)制能力增強(qiáng),同時(shí)在豬原代巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力下降,病毒毒力逐漸衰減,在傳至第110代時(shí)完全喪失。家豬接種完全致弱的ASFV-G毒株后并未獲得相應(yīng)保護(hù)力,以抵抗母本病毒的攻擊[11],表明傳代致弱的ASFV安全性較差且很難提供較好免疫保護(hù)。

    2.2 天然致弱毒株 采用天然致弱ASFV毒株OURT88/3 或NH/P68免疫動(dòng)物后,能誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)同源強(qiáng)毒株的攻毒保護(hù),依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和攻毒毒株的不同,保護(hù)率介于66%~100%[12-15]。研究表明,病毒特異性抗體以及CD8+T細(xì)胞在免疫保護(hù)中均起重要作用,且OURT88/3毒株產(chǎn)生的免疫保護(hù)與病毒特異性IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞呈正相關(guān)性。采用NH/P68免疫后,豬對(duì)高毒力ASFV/L60感染抵抗力增強(qiáng)[13]。以O(shè)URT88/3免疫并用致病性O(shè)URT88/1毒株進(jìn)行加強(qiáng)免疫后,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)ASFV I型不同分離毒株的交叉保護(hù)[12],表明研制具有交叉保護(hù)的ASFV疫苗是可能的。然而,天然致弱毒株免疫動(dòng)物后可造成諸多副反應(yīng),包括肺炎、流產(chǎn)、死亡等,免疫NH/P68毒株后25%~47%的豬呈現(xiàn)慢性感染[13];免疫OURT88/3后可導(dǎo)致發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀[15]。總之,天然致弱毒株導(dǎo)致的諸多副反應(yīng)以及存在散毒的可能性等生物安全隱患限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。

    2.3 重組致弱毒株 采用分子生物學(xué)方法,敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因,可降低病毒毒力或增加機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答,研制比傳統(tǒng)弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程減毒活疫苗。研究表明,一些ASFV毒株在缺失單個(gè)或多個(gè)毒力基因/或免疫抑制基因后,如TK(K196R)、9GL(B119L)、CD2v(EP402R)、DP148R、NL(DP71L)、UK(DP96R)和多基因家族360和505(MGF 360/505),缺失毒株接種宿主毒力減弱且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)同源母本毒株或異源毒株的特異性免疫保護(hù)(表1)[16-19]。ASFV編碼多種蛋白以干擾宿主免疫系統(tǒng),已報(bào)道的病毒免疫逃逸相關(guān)基因包括A238L、A179L、A224L、 DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R等,其編碼蛋白抑制宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素和ISGs的產(chǎn)生,調(diào)控細(xì)胞凋亡、蛋白合成和自噬等多種信號(hào)通路[19-23]。由于這些蛋白質(zhì)可干擾宿主免疫應(yīng)答,從ASFV強(qiáng)毒株中缺失上述基因有助于增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答(表1)。

    安全性和有效性是影響ASF 弱毒活疫苗田間應(yīng)用的重要因素,安全性和有效性與病毒毒株、免疫或感染劑量、病毒接種途徑以及接種動(dòng)物密切相關(guān)。因此,致弱毒株保護(hù)性的強(qiáng)弱、是否有毒力殘留和是否導(dǎo)致持續(xù)感染是弱毒活毒株能否成為候選疫苗毒株的重要決定因素。因此,還需要進(jìn)一步研究以確定適合的缺失靶基因及其組合,以研制可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)且沒(méi)有相應(yīng)副作用的ASFV弱毒活疫苗。

    表1 減毒活疫苗研究進(jìn)展Table 1 Progress towards the development of ASFV live attenuated vaccines

    3 病毒活載體疫苗

    已有研究表明,細(xì)胞免疫和體液免疫在抗ASFV感染中發(fā)揮作用[24-26]。有學(xué)者將ASFV保護(hù)性抗原重組入腺病毒或痘病毒載體,以期獲得更好的細(xì)胞免疫和CTL反應(yīng)。Lokhandwala等[27]將ASFV p32、p54、p72和pp62基因分別重組入人腺病毒Ad5載體中進(jìn)行“雞尾酒”式免疫,獲得了良好的抗原特異性CTL反應(yīng);之后他們又將ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR 、B438L和K205RA104R共7個(gè)ASFV抗原基因,重組入復(fù)制缺陷型腺病毒載體,通過(guò)“雞尾酒”式混合免疫后能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答[28]。上述研究仍需通過(guò)攻毒保護(hù)試驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證病毒活載體疫苗在ASF疫苗開(kāi)發(fā)中的可行性。

    4 核酸疫苗

    ASF核酸疫苗的研究剛剛起步,通過(guò)將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達(dá)載體后,直接導(dǎo)入機(jī)體內(nèi),在宿主細(xì)胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白,從而同時(shí)激活體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Argilaguet等將ASFV p72、p30和p54基因克隆入真核表達(dá)載體,制備ASF DNA疫苗,但該DNA疫苗免疫豬后并不能夠提供攻毒保護(hù)[29,30]。同組科研人員將ASFV p30和p54基因與豬白細(xì)胞抗原II的特異性抗體單鏈可變區(qū)基因在真核表達(dá)載體中融合表達(dá);接種ASF DNA疫苗后,在沒(méi)有誘導(dǎo)產(chǎn)生可檢測(cè)水平ASFV抗體的情況下,能夠使部分動(dòng)物獲得攻毒免疫保護(hù),表明細(xì)胞免疫在ASFV疫苗的免疫中起重要作用[30]。最新研究表明,根據(jù)一個(gè)或兩個(gè)ASFV抗原構(gòu)建的DNA疫苗并不能誘導(dǎo)較高免疫保護(hù),而免疫ASFV基因組DNA質(zhì)粒表達(dá)文庫(kù)能夠提供60%的保護(hù)力,說(shuō)明有待于發(fā)掘更多保護(hù)性抗原,以提高核酸疫苗的保護(hù)水平[31]。

    5 亞單位疫苗

    ASF亞單位疫苗只包含特定的病毒抗原,需通過(guò)合適抗原傳遞系統(tǒng)免疫動(dòng)物。鑒定可以引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的抗原及其表位,有助于開(kāi)發(fā)有效的ASFV亞單位疫苗。研究表明,針對(duì)病毒p30蛋白的抗體在細(xì)胞水平抑制超過(guò)95%的ASFV內(nèi)化,p72和p54的抗體能夠抑制病毒吸附,表明這些蛋白在ASFV感染中發(fā)揮作用。用重組p30或p54蛋白免疫豬后可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,但不能提供針對(duì)急性ASF感染的保護(hù)[32];相比之下,同時(shí)免疫 p30和p54蛋白或兩種蛋白的嵌合體可以提供部分保護(hù)[32,33]。用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p72、p30和p54等,以蛋白復(fù)合物作為抗原免疫動(dòng)物后仍不能提供有效的免疫攻毒保護(hù)[32-34],說(shuō)明僅僅依靠上述抗原刺激產(chǎn)生的中和抗體很難獲得理想的免疫保護(hù)效果。在另一組研究中,Lopera-Madrid等[35]分別以人源293 (HEK) 細(xì)胞表達(dá)的ASFV B646L (p72)、E183L (p54)和O61R (p12)亞單位抗原,或者痘苗病毒載體疫苗進(jìn)行首免和加強(qiáng)免疫,獲得較好的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。因此,需要研究鑒定更多的ASFV保護(hù)性抗原、開(kāi)發(fā)新型免疫佐劑以及采用DNA首免蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫策略,以提高ASF基因工程亞單位疫苗的免疫效力。

    6 展望

    2017年初至今,俄羅斯境內(nèi)多個(gè)州發(fā)生ASF疫情,其中,伊爾庫(kù)茨克州、鄂木斯克州發(fā)生地點(diǎn)距離我國(guó)邊境較近,因此對(duì)于我國(guó)疫情防控而言,除做好風(fēng)險(xiǎn)防范工作以外,研發(fā)安全有效ASF疫苗也迫在眉睫。過(guò)去的幾十年中,對(duì)ASF疫苗的研究雖取得了較大進(jìn)展,包括評(píng)估細(xì)胞傳代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗,但是所有努力都未能研制出可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的疫苗。通過(guò)基因重組技術(shù),獲得安全、高效ASFV減毒活疫苗仍是ASFV疫苗開(kāi)發(fā)的首選策略。然而,仍有一些問(wèn)題需要考慮,包括弱毒疫苗在體內(nèi)的安全性研究,以及鑒定并開(kāi)發(fā)適合弱毒活疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系等[36]。研發(fā)可鑒別野毒感染和疫苗免疫的ASF亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗、以及復(fù)制缺陷型疫苗[37]也是研發(fā)ASFV疫苗的重要策略,尤其是在沒(méi)有疫病流行地區(qū)的使用。與減毒活疫苗相比,這些疫苗的生物安全性有所提高,但鑒定病毒保護(hù)性抗原,有效的遞送機(jī)制以及高效的免疫佐劑[38,39]都需要長(zhǎng)期的研究和探索。

    87 國(guó)外畜牧學(xué)-豬與禽 4-361 月刊 96.00 潘雪男 021-62209279 上海市閔行區(qū)北翟路2901號(hào) 201106 shzyq2005@126.com

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