心臟M2乙酰膽堿能受體自身抗體與肥厚型心肌病的相關性研究

段欣，劉蓉，高曉津，羅曉亮，胡奉環(huán)，王娟，郭超，胡小瑩，春語詩，袁建松，劉圣文，張麟，楊偉憲，喬樹賓

心力衰竭（心衰）是由于各種心臟結構或功能性疾病導致心室充盈和（或）射血功能受損而引起的一組綜合征，神經體液代償機制是其重要病理生理機制之一。心衰患者交感神經興奮性異常增強，血中兒茶酚胺水平升高，作用于心臟β1腎上腺素能受體，提高心肌收縮力、心率及心排血量。在此過程中可能伴有副交感神經興奮性反射性增加，釋放乙酰膽堿與心臟M2乙酰膽堿能受體相結合，通過修飾抑制性G蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶，導致第二信使cAMP的生成減少，發(fā)揮拮抗作用，使心率減慢、降低心肌收縮力和心排血量[1]。近年來，心衰的免疫機制也逐漸得到認識，當心臟β1和M2受體之間的動態(tài)平衡失調時，β1受體的自身抗體（β1-AAb）和M2乙酰膽堿能受體自身抗體（M2-AAb）產生幾率增加，二者分別與各自相應受體的細胞外第二環(huán)相結合，產生激動劑樣作用，引起自身免疫反應損傷心肌細胞甚至心功能[2]。既往研究發(fā)現，多種不同病因導致的收縮功能不全的心衰患者血清M2-AAb陽性率較正常人群均顯著升高，如擴張型心肌病、缺血性心肌病、風濕性心臟病等，不同病因組間無明顯差異，而與心衰的程度相關，提示M2-AAb水平可能與心肌損傷重構和心衰相關[3]。與收縮功能障礙為主的心臟病不同，肥厚型心肌病（HCM）主要表現為不同程度的舒張功能障礙，關于HCM患者血清M2-AAb水平及其與臨床表現之間的關系國內外少有報道，且早期研究均為M2-AAb的定性或半定量研究，鮮有定量研究。本研究定量檢測HCM患者血清M2-AAb的濃度，并研究其與HCM患者臨床指標的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選2016-04至2017-03于中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院就診的133例HCM患者為HCM組，男性81例。HCM組進一步分為梗阻性肥厚型心肌?。℉OCM）亞組（72）、隱匿梗阻性肥厚型心肌?。↙HOCM）亞組（22）、非梗阻性肥厚型心肌?。∟OCM）亞組（39），由于靜息狀態(tài)采血時LHOCM和NOCM患者均無左心室流出道（LVOT）梗阻，又將LHOCM、NOCM患者歸為LHOCM+NOCM亞組（61），并與HOCM亞組作比較。另選擇經12導聯心電圖、經胸超聲心動圖及血液學常規(guī)檢驗結果證實無器質性心臟病及自身免疫性疾病，且未服用β受體阻滯劑、糖皮質激素及免疫抑制劑的40例受試者為正常對照組，男性22例，女性18例。

HCM的診斷標準為：經胸超聲心動圖或心臟核磁共振測定的最大左心室室壁厚度≥15 mm或有明確HCM家族史者，最大左心室室壁厚度≥13 mm，且沒有其他心臟或全身性疾病可代償性或繼發(fā)性引起同等程度的心肌肥厚[4]。LVOT梗阻定義為靜息狀態(tài)或生理性激發(fā)（如運動）時LVOT壓力階差≥30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。靜息狀態(tài)LVOT壓力階差≥30 mmHg者為HOCM；靜息狀態(tài)LVOT壓力階差＜30 mmHg，而生理性激發(fā)后≥30 mmHg為LHOCM；靜息狀態(tài)及激發(fā)后LVOT壓力階差均＜30 mmHg為NOCM[5]。所有入選者均行超聲心動圖檢查證實符合上述診斷標準。

排除標準：（1）合并可導致心臟結構和功能發(fā)生顯著變化的疾病如心肌梗死、缺血性心肌病、先天性心臟病、風濕性心臟病、瓣膜性心臟病、擴張型心肌?。唬?）接受過Morrow手術、經皮室間隔化學消融術或已植入起搏器；（3）嚴重的肝、腎疾病，自身免疫性疾病，惡性腫瘤；（4）半年內創(chuàng)傷、手術史；（5）急、慢性感染性疾病或急性感染恢復期；（6）目前應用糖皮質激素或免疫抑制劑。

1.2 臨床評估指標

對入選者進行完整病史采集、體格檢查，均行12導聯心電圖、經胸超聲心動圖、24小時動態(tài)心電圖、心臟磁共振及血液學常規(guī)檢驗。其中血液學常規(guī)檢驗由阜外醫(yī)院檢驗科完成，主要包括血常規(guī)、肝腎功、電解質、心肌梗死三項、N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）、大內皮素、C反應蛋白（CRP）、高敏C反應蛋白（hs-CRP）、同型半胱氨酸、糖化血紅蛋白等。對常規(guī)經胸超聲心動圖LVOT壓力階差＜30 mmHg的患者行運動負荷超聲心動圖，運動負荷超聲檢查前至少停用β受體阻滯劑及鈣拮抗劑等控制心率的藥物1天。

1.3 樣本分析方法

所有入選者均空腹采外周靜脈血，采血前3天未用或停用β受體阻滯劑，靜置后離心（3000 r/min離心15 min），取血清保存于-80℃冰箱待測。采用人M2-AAb 的酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（上海Blue Gene，產品編號E01C0534）檢測血清M2-AAb濃度，按試劑盒說明書要求進行操作。酶標儀測定光密度（OD）值，將測得的每個樣本的OD值根據四參數Logistic標準曲線計算出每個樣本的M2-AAb濃度。用于計算標準曲線方程的六個標準品濃度分別為0、10、25、50、100、250 ng/ml，標準曲線的R2值均大于0.99。為保證實驗的可靠性，每個樣本均進行雙孔同時測定，雙孔間變異系數≤10%，取平均值為每個樣本的最終M2-AAb濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析方法

所有統(tǒng)計學分析均運用SPSS19.0軟件進行。對于符合正態(tài)分布的計量資料，用均數±標準差表示，兩組間比較用獨立樣本的t檢驗；對不符合正態(tài)分布的計量資料，用中位數（四分位數）表示，兩組間比較用非參數Mann-Whitney U檢驗。兩連續(xù)變量之間的相關性分析應用Pearson相關性檢驗或Spearman秩相關。P＜0.05為差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組受試者間血清M2-AAb濃度比較（表1）：HCM組患者血清M2-AAb濃度顯著高于正常對照組（P1＜0.05）。HOCM亞組、LHOCM亞組、NOCM亞組患者的血清M2-AAb濃度也均顯著高于正常對照組（P＜0.05）。亞組分析兩兩比較HOCM亞組、NOCM亞組和LHOCM亞組患者的血清M2-AAb濃度在三組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。將LHOCM、NOCM患者歸為一組，比較其與HOCM患者的血清M2-AAb濃度，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組受試者間血清M2-AAb濃度比較

不同臨床特征的HCM患者的M2-AAb濃度分析（表2）：女性HCM患者M2-AAb濃度顯著高于男性（P=0.001）。有猝死家族史的患者的血清M2-AAb濃度顯著高于無猝死家族史者（P＜0.05）。有心房顫動、合并中-重度二尖瓣反流或左心房內徑≥50 mm的患者的血清M2-AAb濃度顯著高于無心房顫動，不合并中-重度二尖瓣反流或左心房內徑＜50 mm的患者（P均 ＜0.05）。

HCM患者血清M2-AAb水平與臨床指標的相關性分析（表3）：為使M2-AAb數值呈正態(tài)分布，對其進行了對數轉換。研究發(fā)現，logM2-AAb與靜息LVOT壓力階差呈顯著正相關（r=0.178，P=0.040），與HOCM組靜息LVOT壓力階差呈臨界性正相關（r=0.224，P=0.058），其他指標與logM2-AAb未顯示顯著線性相關性。

表2 不同臨床特征的肥厚型心肌病患者的血清M2-AAb濃度分析[中位數（四分位數）]

表3 肥厚型心肌病患者血清logM2-AAb水平與臨床指標的相關性分析

3 討論

既往對不同病因收縮功能不全的心衰患者進行研究提示M2-AAb濃度可能與心肌損傷和心衰相關。幾乎所有HCM患者都有不同程度的心肌損傷、重構及心室舒張功能不全。由于心肌細胞肥大，冠脈小血管床密度減低，心肌氧供需失衡，微血管功能障礙均可導致心肌細胞凋亡或壞死，并可出現心肌纖維化。心室壁順應性下降、左心室流出道梗阻、心室重構以及心律失常都會加重心室舒張功能不全[6]。1999年，國外學者Peuekert等[7]首次證實HCM患者血清β1-AAb和（或）M2-AAb總陽性率顯著高于正常對照組，且自身抗體陽性可能與病情嚴重程度相關。此后國內外研究中鮮有關于HCM患者血清M2-AAb的進一步研究報道，近期劉蓉等[8]半定量測定HOCM患者M2-AAb，其陽性率及平均抗體滴度均顯著高于正常對照組。本研究定量測定各類型HCM患者血清M2-AAb濃度，結果顯示HCM患者血清M2-AAb濃度顯著高于正常對照組。推測HCM患者血清M2-AAb濃度升高可能與心肌損傷重構和心室舒張功能不全相關。

本研究顯示，女性HCM患者血清M2-AAb濃度顯著高于男性患者。國內外文獻鮮有涉及M2-AAb水平性別差異的報道，但一項梅奧醫(yī)學中心的研究入選了1975～2012年間的3 673例HCM患者（包括1661例女性），中位隨訪期為10.9年，研究顯示女性HCM患者較男性癥狀更明顯，心肺運動耐量更差，血流動力學改變更顯著，生存率更低，可能需要更積極的診治，其多因素模型顯示女性與死亡率獨立相關[9]。另一項針對中國HCM患者的研究入選了1999～2011年間的621例HCM患者（包括161例女性），平均隨訪4年，顯示出相似的研究結果，女性是HCM患者全因死亡率、心血管死亡和進展為慢性心衰的獨立危險因素[10]。由此可見，不同性別的HCM患者其疾病進程和預后可能存在差異，本研究中不同性別患者M2-AAb濃度的差別可能提示參與HCM的自身免疫機制或許存在性別差異，由此是否可解釋女性HCM預后更差的原因尚需今后進一步研究。

惡性心律失常是心原性猝死的最常見原因，可為快速性心律失常如室性心動過速、心室顫動或緩慢性心律失常如心動過緩或心臟停搏。本研究顯示，有猝死家族史的HCM患者血清M2-AAb濃度顯著高于無此家族史者。推測M2-AAb濃度升高進一步激動心臟M2受體可能會增加緩慢性心律失常的發(fā)生。另外，有研究表明，部分M2-AAb陽性的Chagas心臟病患者QT離散度增加，而QT離散度正是心室復極不均一性的指標，與室性心律失常和猝死發(fā)生率增加相關[11]。猝死家族史是指有兩個或兩個以上有血緣關系的家庭成員在40歲之前發(fā)生猝死。研究表明猝死家族史可作為評估HCM患者發(fā)生猝死可能性的獨立預測因素[12]，HCM是一種傳統(tǒng)意義上的單基因疾病，呈常染色體顯性遺傳，有些基因突變如MYH7、TNNT2所致的HCM猝死發(fā)生率高，預后差，被稱為“惡性突變”。HCM既具有遺傳異質性，也具有表型異質性。有研究入選了2 062 例擴張性心肌病和缺血性心肌病慢性心衰患者，測定血清β1-AAb和 M2-AAb，并隨訪 36 個月，研究發(fā)現，β1-AAb是預測擴張性心肌病和缺血性心肌病猝死的獨立預測因子，但M2-AAb與此方面無明顯關聯[13]。HCM患者心臟自身受體抗體的表達是否與遺傳異質性相關，尚需今后進一步研究。

本研究顯示合并心房顫動、或左心房內徑≥50 mm或中-重度二尖瓣反流的HCM患者的血清M2-AAb濃度顯著高于不合并者。左心房壓升高和左心房擴大是心房顫動發(fā)生的病理基礎，心房顫動的發(fā)生會造成HCM患者在心室舒張功能不全的基礎上伴隨心房收縮功能喪失、心排血量下降，導致心衰進一步惡化，可引起血清M2-AAb濃度升高。動物實驗顯示，M2-AAb陽性的家兔較對照組心房內激動時間更長，心房有效不應期更短，導致房性心律失常明顯增加[14]。由于入選時已除外心臟瓣膜病，故二尖瓣反流均繼發(fā)于SAM征，加重LVOT梗阻，并引起左心室舒張末期壓力和室壁張力增加，進一步導致心肌肥厚、心肌重構和心室舒張功能障礙，促進M2-AAb的產生。相關性分析中顯示，HCM患者logM2-AAb與靜息LVOT壓差呈顯著正相關，亞組分析提示在HOCM患者中l(wèi)ogM2-AAb與靜息LVOT壓差達臨界性正相關。LVOTG升高加重心臟舒張功能不全及心肌損傷重構，可引起血清M2-AAb濃度升高。

綜上所述，HCM患者血清M2-AAb濃度顯著高于正常人群，性別、是否有猝死家族史可能影響其濃度。合并心房顫動、左心房內徑≥50 mm或二尖瓣中-重度反流的HCM患者血清M2-AAb水平顯著升高。HCM患者血清M2-AAb濃度與靜息LVOT壓差相關。提示血清M2-AAb濃度能夠在一定程度上反映HCM患者的心肌損傷和心臟舒張功能障礙，對探索HCM發(fā)生發(fā)展的機制有一定意義，有待進行進一步的研究。

[1] Stavrakis S, Kem DC, Patterson E, et al. Opposing cardiac effect of autoantibody activation of β-adrenergic and M2muscarinic receptors in cardiac-related diseases[J]. Int J Cardiol, 2011, 148(3): 331-336.DOI: 10. 1016/j. ijcard. 2009. 11. 025.

[2] Matsui S, Fu ML, Shimizu M, et al. Dilated cardiomyopathy defines serum autoantibodies against G-protein-coupled cardiovascular receptors[J]. Autoimmunity, 1995, 21(2): 85-88.

[3] 張麟, 胡大一, 史旭波, 等. 心臟β1和M2受體自身抗體與心力衰竭的研究[J]. 中華內科雜志, 2001, 40(7): 445-447.

[4] Gersh BJ, Maron BJ, Bonow RO, et al. 2011 ACCF/AHA guideline for the diagonsis and treatment of hypertrophic cardiomyopathy: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on practice guidelines. developed in collaboration with the American Association for Thoracic Surgery,American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Heart Failure Society of America, Heart Rhythm Society,Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, and Society of Thoracic Surgeons[J]. J Am Coll Cardiol, 2011, 58(25): e212-e260.DOI: 10. 1016/j. jacc. 2011. 06. 011.

[5] Maron MS, Olivotto I, Zenovich AG, et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction[J]. Circulation, 2006, 114(21): 2232-2239. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA. 106. 644682.

[6] 喬樹賓. 肥厚型心肌病——基礎與臨床[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012: 95-105.

[7] Peukert S, Fu ML, Eftekhari P, et al. The frequency of occurrence of anti-cardiac receptor autoantibodies and their correlation with clinical manifestation in patients with hypertrophic cardiomyopathy[J].Autoimmunity, 1999, 29(4): 291-297.

[8] 劉蓉, 喬樹賓, 胡奉環(huán), 等. 心臟 β1腎上腺素能受體和 M2乙酰膽堿能受體的自身抗體與肥厚型心肌病的關系研究[J]. 中國循環(huán)雜志, 2017, 32(11): 1104-1106. DOI: 10. 3969/j. issn. 1000-3614.2017. 11. 014.

[9] Geske JB, Ong KC, Siontis KC, et al. Women with hypertrophic cardiomyopathy have worse survivalv[J]. Eur Heart J, 2017, 38(46):3434-3440. DOI: 10. 1093/eurheartj/ehx527.

[10] Wang Y, Wang J, Zou Y, et al. Female sex is associated with worse prognosis in patients with hypertrophic cardiomyopathy in China[J].PLoS One, 2014, 9(7): e102969. DOI: 10. 1371/journal. pone.0102969. eCollection 2014.

[11] Medei E, Pedrosa RC, Benchimol Barbosa PR, et al. Human antibodies with muscarinic activity modulate ventricular repolarization: basis for electrical disturbance[J]. Int J Cardiol, 2007, 115(3): 373-380. DOI:10. 1016/j. ijcard. 2006. 03. 022.

[12] Christiaans I, van Engelen K, van Langen IM, et al. Risk stratification for sudden cardiac death in hypertrophic cardiomyopathy: systematic review of clinical risk markers[J]. Europace, 2010, 12(3): 313-321.DOI: 10. 1093/europace/eup431.

[13] Pei J, Li N, Chen J, et al. The predictive values of beta1-adrenergic and M2muscarinic receptor autoantibodies for sudden cardiac death in patients with chronic heart failure[J]. Eur J Heart Fail, 2012, 14(8):887-894. DOI: 10. 1093/eurjhf/hfs082.

[14] Hong CM, Zheng QS, Liu XT, et al. Effects of autoantibodies against M2 muscarinic acetylcholine receptors on rabbit atria in vivo[J].Cardiology, 2009, 112(3): 180-187. DOI: 10. 1159/000149152.