愈癲湯對MK-801致精神分裂癥模型大鼠Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響?

趙玉萍，柴劍波，高 瀟，于 明，趙永厚△

(1. 黑龍江神志醫(yī)院,哈爾濱 150036； 2. 黑龍江神志醫(yī)院博士后科研工作站,哈爾濱 150036；復(fù)旦大學(xué)博士后中西醫(yī)結(jié)合流動站,上海 200433)

谷氨酸-多巴胺(Glu-DA)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂是精神分裂癥發(fā)病的重要機(jī)制[1]。中醫(yī)神志病學(xué)認(rèn)為，精神分裂癥病位在腦，核心病機(jī)為痰瘀互結(jié)、腦神失調(diào)，據(jù)此化裁愈癲湯乃黑龍江神志醫(yī)院院內(nèi)制劑經(jīng)驗(yàn)方，臨證取得確切療效。本研究以谷氨酸(Glu)-多巴胺(DA)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)為切入點(diǎn)，觀察“消痰化瘀”之愈癲湯對精神分裂癥模型大鼠腦組織NO活性、MDA含量及nNOSmRNA、DA、Glu表達(dá)情況的影響，為闡明其干預(yù)精神分裂癥的作用機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

48只雄性成年SD大鼠(300±20 g)，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心(合格證號SCXK(黑)2013-004)。

1.2 藥物

愈癲湯組成：制半夏15 g，制天南星15 g，牽牛子10 g，三棱15 g，莪術(shù)15 g，檳榔15 g，大黃10 g，茵陳蒿15 g。將1劑上述飲片放入煎藥器皿中加12倍量清水浸泡2 h，武火煎煮10 min，文火再煎煮30 min后過濾煎液，之后再加8倍量水武火煎煮10 min，文火再煎煮30 min過濾煎液,濾除藥渣后將2次煎煮藥液合并加熱濃縮至111 ml后，藥液濃度為0.92 g/ml。

利培酮片：江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號20120501)，購自黑龍江神志醫(yī)院藥局。將4 mg利培酮片研成粉末，加111 ml蒸餾水后恒溫水浴震蕩20 min，配制成0.036 mg/ml的利培酮懸濁液。地卓西平(MK-801)注射液：取MK-801(美國SIGMA公司生產(chǎn))1 mg溶于1 ml氯化鈉溶液中，配制成濃度為1 mg/ml儲備藥液，造模時將儲備藥液稀釋為0.1 mg/ml注射液。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：神經(jīng)型一氧化氮試劑盒(南京建成A012)；MDA測定試劑盒(南京建成A003-1)；高純總RNA快速提取試劑盒(中國BioTeke RP1201)。主要儀器：ELX-800型酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)；UV752型紫外可見光分光光度計(jì)(湖南湘儀)；Life Express-PCR儀(杭州BIOER)；凝膠成像分析儀(北京六一WD-9413B)及LC-6 A高效液相色譜儀(日本島津)。

2 方法

2.1 分組

實(shí)驗(yàn)大鼠自由攝食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件為每只動物自然序號賦予1個3位隨機(jī)數(shù)，按隨機(jī)數(shù)大小分入空白組、模型組、利培酮組及愈癲湯組，每組各12只。

2.2 造模方法

除空白組外，各組大鼠按照0.1 mg/kg體質(zhì)量劑量腹腔注射0.1 mg/mLMK-801注射液，注射位置選擇大鼠左或右(每日交替)下側(cè)腹腔略靠近外側(cè)1/3處；空白組大鼠應(yīng)用0.9%氯化鈉溶液行相同方法腹腔注射，連續(xù)14 d[1-3]。

2.3 給藥方法

于實(shí)驗(yàn)開始第15天進(jìn)行干預(yù)性給藥，空白組、模型組給予蒸餾水灌胃(1 ml/100 g)，對照組及治療組大鼠于模型制備成功后分別給予利培酮懸濁液灌胃(0.5 ml/100 g)，愈癲湯水煎劑灌胃(1 ml/100 g)，持續(xù)灌胃14 d。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.4.1 應(yīng)用分光光度計(jì)測定額前腦組織NO活性、MDA含量 加入9倍體積PBS，將額前腦組織打碎后用液氮反復(fù)凍融3次，應(yīng)用12000 r/min離心10 min，取上清液低溫冷凍待用。通過蛋白質(zhì)定量測定制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照試劑盒說明書操作并計(jì)算NO活性和MDA含量。

2.4.2 應(yīng)用PCR法測定額前腦組織nNOSmRNA的表達(dá) 應(yīng)用RNA試劑盒提取樣本總RNA，將得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，對上步實(shí)驗(yàn)所得的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到對應(yīng)的cDNA，建立PCR反應(yīng)體系，將引物按照設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)程序操作，之后經(jīng)電泳過后利用凝膠成像系統(tǒng)對得到的凝膠進(jìn)行拍照，并應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析光密度值得出結(jié)果。

2.4.3 HPLC-ECD法測定額前腦組織Glu、DA表達(dá)情況 選用HPLC-ECD將冷凍的額前腦組織加1 mL預(yù)冷的95%乙醇，12000 r/min離心3 min，然后取5 μL樣品于離心管中，加入50 μL衍生工作液渦旋震蕩1 min，取樣20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖計(jì)算峰面積，得出Glu、DA表達(dá)情況。

2.5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠額前葉組織NO活性、MDA含量、nNOSmRNA表達(dá)比較

表1顯示，與空白組比較，模型組NO活性、MDA含量及nNOSmRNA表達(dá)皆明顯升高(P<0.01，P<0.05)；而治療組能顯著降低NO活性、MDA含量及nNOSmRNA表達(dá)(P<0.05)，且在降低MDA方面明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。

表1 各組大鼠額前腦組織NO活性、MDA含量、nNOSmRNA表達(dá)比較

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05；與對照組比較:■P<0.05

3.2.各組大鼠額前葉組織Glu、DA表達(dá)比較

表2顯示，與空白組比較模型組Glu表達(dá)程度明顯降低，DA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；而治療組能顯著升高Glu的表達(dá)，降低DA的表達(dá)，且明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。

表2 各組大鼠額前腦組織Glu、DA表達(dá)情況比較

注：與空白組比較:*P<0.05；與模型組比較:▲P<0.05；與對照組比較:■P<0.05

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，精神分裂癥的發(fā)病與Glu神經(jīng)元功能障礙及DA功能亢進(jìn)密切相關(guān)，且精神分裂癥發(fā)病極易體現(xiàn)出二者同時出現(xiàn)所相關(guān)聯(lián)的Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂。一般認(rèn)為，腦組織中Glu和DA是一對具有相互調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)遞質(zhì)，精神分裂癥患者腦組織內(nèi)特別是額前組織中存在Glu能神經(jīng)元功能不足，并由此導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)過度釋放DA，經(jīng)由紋狀體-丘腦-皮質(zhì)通路刺激皮質(zhì)Glu能神經(jīng)元，結(jié)果形成正反饋而最終導(dǎo)致Glu的過度釋放形成神經(jīng)毒性。Glu神經(jīng)毒性可導(dǎo)致NO信號通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活，基于NO信號通路角度，Glu神經(jīng)毒性可以使NMDA受體激活增多，致細(xì)胞內(nèi)游離Ca+濃度增加，使nNOS從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)而生成NO，NO進(jìn)而反作用于Glu進(jìn)一步導(dǎo)致Glu的過度釋放加重神經(jīng)毒性。鑒于Glu與DA的互相調(diào)節(jié)作用，其可以使DA病理性的加速釋放[4-9]。而基于氧化應(yīng)激反應(yīng)角度，Glu神經(jīng)毒性可以導(dǎo)致MDA含量升高，致DA神經(jīng)元出現(xiàn)神經(jīng)毒性反應(yīng)甚則凋亡[10]。故精神分裂癥可見Glu神經(jīng)元功能障礙及DA功能亢進(jìn)同時出現(xiàn)，具體表現(xiàn)為Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂。

中醫(yī)神志病學(xué)認(rèn)為，精神分裂癥屬于中醫(yī)“癲狂病”范疇，其所具有的潛伏期長、癥狀隱匿等特殊的發(fā)病特點(diǎn)，使得臨證中痰瘀互結(jié)型患者尤為多見，在病理特點(diǎn)上體現(xiàn)出典型的痰凝血瘀證候特征。因此，本病的治療亦應(yīng)從痰瘀入手，以消痰化瘀、破結(jié)行氣為綱。據(jù)此，擬愈癲湯方以3組藥物分領(lǐng)滌痰、祛瘀、行氣三岐。半夏、南星燥濕化痰，消痞散結(jié)；牽牛子性寒味苦，消飲滌痰，三者相伍則祛痰之功卓著。三棱、莪術(shù)破血逐瘀而行氣，檳榔行氣消積，三者相伍使瘀行氣暢。同時牽牛子得檳榔之助，則氣順而痰自消，行氣之功增強(qiáng)；檳榔得牽牛子之輔，破氣之功更著。瘀久必化熱，茵陳蒿利濕清熱，亦可得大黃利濕之助。且方中大黃既可攻積瀉下，給痰瘀之邪以出路，又兼化瘀之力。綜觀全方,痰瘀同治、氣血兼調(diào)則必使痰濁漸去而瘀血漸消,腦竅再現(xiàn)清靈通利之功。

研究發(fā)現(xiàn)，消痰活血之愈癲湯可顯著抑制精神分裂癥模型大鼠額前腦組織內(nèi)MDA含量、NO活性及nNOSmRNA的表達(dá)，表現(xiàn)出對MK-801所致精神分裂癥模型大鼠額前腦組織內(nèi)Glu及DA表達(dá)的正性調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮了顯著穩(wěn)定Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的作用，提示愈癲湯可能通過阻斷NO信號通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)消除Glu神經(jīng)毒性，維持Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

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