TCIRG1基因突變致嬰兒惡性石骨癥1例并文獻復習

張瀟瀟 陸 敏 吳蓓蓉 董曉艷 顧浩翔

1 病例資料

女，8月齡，因“咳嗽10 d，病程中發(fā)熱1次”入住上海市兒童醫(yī)院(我院)?；純河谌朐呵?0 d與感冒家人接觸后出現咳嗽，為陣發(fā)性連聲咳，有痰不易咳出，病程中發(fā)熱1次，熱峰38.3℃，無喘息，無吐瀉，至外院就診。血常規(guī)：WBC 26.79×109·L-1,N 0.26，L 0.62，CRP 2.55 mg·L-1。X線胸片示兩肺紋理增粗、增多，胸廓諸骨密度增高，兩側肱骨密度增高，近端干骺端骨質破壞，鄰近見骨膜反應。先后

予頭孢他啶、環(huán)酯紅霉素和羅氏芬治療，未見好轉。為進一步診治，收入我院。病程中精神、胃納可，二便正常。

出生史及家族史：患兒系G1P1，足月順產，出生史無異常?；純耗赣H孕期有缺鈣，父母非近親結婚，否認家族性、遺傳性病史。

既往史：6月齡時外院確診先天性髖關節(jié)脫位。

查體：T 36.7℃，P 150 ·min-1，R 34·min-1，體重7 kg(P3)，身長65 cm(P3)，BP 82/48 mmHg。神志、精神可，呼吸平穩(wěn)，面色略蒼白，全身皮膚未見皮疹及淋巴結腫大。方顱，前額突出，雙眼震顫，頸軟，咽部充血，牙齒未萌出，漏斗胸，雙側肋緣外翻，雙肺呼吸音粗，雙肺可聞及痰鳴音。心率150·min-1，律齊，未及雜音。腹部膨隆，肝肋下3 cm，脾肋下3 cm，質韌。雙下肢髖關節(jié)復位帶固定中。肛門、生殖器未見異常，神經系統(tǒng)查體未見異常。

實驗室檢查：血常規(guī)示WBC 16.05×109·L-1，RBC 2.83×1012·L-1，Hb 78 g·L-1，PLT 141×109·L-1，N 0.26，L 0.64，CRP 5 mg·L-1，網織紅細胞7.42%，有核紅細胞47×109·L-1。肝腎功能電解質正常，堿性磷酸酶960 U·L-1，乳酸脫氫酶893 U·L-1，球蛋白5 g·L-1，血清鈣2.03 mmol·L-1，25羥維生素D 31.68 nmol·L-1。血串聯質譜未見異常。病原學檢查陽性：呼吸道包括近平滑假絲酵母菌(痰培養(yǎng))、軍團菌(血清抗體)、鼻病毒(血清抗體)、單純皰疹病毒(血清抗體)；胃腸道包括諾如病毒(糞便病毒RNA)、光滑念珠菌(糞便培養(yǎng))。骨髓穿刺細胞學：骨髓增生活躍，粒紅比倒置，粒系增生，紅系增生明顯活躍，巨核細胞系增生低下，血小板散在少見。骨髓細胞免疫分型未見異常。

影像學及其他檢查：X線片示兩肺紋理增粗、增多，胸廓諸骨密度增高，兩側肱骨密度增高，近端干骺端骨質破壞，鄰近見骨膜反應；雙側股骨及脛腓骨改變，考慮骨代謝性疾病(圖1)。頭顱MRI示腦發(fā)育不良，幕上腦室積水伴腦白質水腫，扁桃腺位置低下。眼底及聽力檢查未見異常。

診治經過：入院后予阿莫西林克拉維酸鉀、紅霉素和伊曲康唑抗感染，丙種球蛋白支持治療。血液科會診，考慮嬰兒惡性石骨癥(IMO)，不能排除合并其他遺傳性疾病，建議行高通量二代基因測序明確診斷。住院10 d后患兒肺炎好轉出院。

圖1 患兒全身骨骼X線表現

注 A：肋骨、鎖骨等胸部骨骼密度明顯增高；B．顱骨明顯骨化，顱底骨密度高；上肢可見“骨中骨”征象；C.椎體上下緣增厚致密，中央部密度相對較低，呈現“夾心椎”征象；D．髂骨翼呈“暈輪樣”改變，下肢長骨密度明顯增高，干骺端呈“燒瓶樣”改變

基因檢測方法及結果：采集患兒及父母外周靜脈血，患兒行全基因組高通量測序(遺傳性血液和免疫系統(tǒng)疾病基因檢測)檢查。血樣抽提基因組DNA后，用超聲儀將DNA隨機打斷成300～400 bp片段，磁珠純化后產物經末端修復后進行接頭連接、PCR擴增，形成測序文庫，使用illumina測序儀測序(Pair End，片段長度150 bp)。采用Qubit檢測文庫濃度，Agilent 2100 Bio analyzer檢測文庫片段長度和濃度。原始測序(fastq格式)數據首先采用FastQC進行數據質量評估，給出基本統(tǒng)計信息、堿基質量分布、ATCG比例分布、GC含量分布、測序讀長分布、重復水平評估和接頭序列比例等數值；采用BWA和GATK算法推薦流程將原始數據比對到參考基因組(hg19)得到bam格式文件，運用GATK中部分模塊對比對結果進行質量統(tǒng)計，包括比對率、PCR冗余度、測序深度等；采用GATK算法推薦流程從bam格式文件中進行變異獲取并統(tǒng)計，包括單核苷酸位點變異 (SNV)、小片段插入和缺失、拷貝數變異 (CNV)、結構變異 (SV)。獲取變異后，由上海新培晶醫(yī)學檢驗所生物信息小組開發(fā)的遺傳性血液和免疫系統(tǒng)疾病基因檢測自動分析系統(tǒng)進行后續(xù)分析。該系統(tǒng)首先對變異位點進行篩選、注釋和分析，包括數據質控、位點位置篩選、公共人群頻率篩查、本地人群頻率篩查、疾病數據庫(如ClinVar、dbSNP、ExAc、1000 Genomes Project等)對變異進行注釋、ANNOVAR功能注釋、疾病遺傳模式評估、公共數據庫或內部數據庫既往報道情況的分析等步驟，得到優(yōu)選致

病位點，進一步得到符合臨床表型的疑似致病位點，交由上海新培晶醫(yī)學檢驗所分析報告團隊進行人工審核。同時對有意義的突變位點進行一代測序驗證?；驒z測發(fā)現TCIRG1基因存在無義突變c.1360C>T(p.R454X)和移碼缺失c.722delC(p.T241fs)，分別遺傳自患兒父母，考慮為復合雜合致病。

隨訪：感染情況控制良好，IMO病變未進一步惡化，目前于北京市兒童醫(yī)院血液科等待配型中。

2 文獻復習

在PubMed、Springer Link和Elsevier數據庫中檢索IMO的英文文獻，以PubMed為例，檢索式為(("osteopetrosis"[MeSH Terms] OR "osteopetrosis"[All Fields]) OR (Autosomal[All Fields] AND recessive[All Fields] AND ("osteopetrosis"[MeSH Terms] OR "osteopetrosis"[All Fields]))) OR (Infantile[All Fields] AND malignant[All Fields] AND ("osteopetrosis"[MeSH Terms] OR "osteopetrosis"[All Fields]))。在萬方、CNKI數據庫中檢索國內有關IMO的報道，以萬方數據庫為例，檢索式為cql://keywords= "石骨癥" OR "骨硬化癥" OR "大理石骨病"。檢索時間為建庫至2018年6月17日。共檢出100篇相關文獻[s1-s100][s1-s100文獻見中國循證兒科雜志電子版(www.cjebp.net)該文附件]，報道IMO 238例，根據病例來源分類，國內128例[s1-s33](包括本文1例)，國外110例[s34-s100]。

77例(國外58例[s34-s61]，國內19例)[s1-s11]行基因測序，共發(fā)現6種致病基因，國內19例均為TCIRG1基因突變(表1)。

表1 77例嬰兒惡性石骨癥患兒基因檢測結果[n(%)]

表2顯示已報道的IMO相關TCIRG1基因突變位點有51個(包括本例)，包括缺失突變(16/51，31.4%)、剪切異常突變(10/51，19.6%)、無義突變(9/51，17.6%)、錯義突變(8/51，15.7%)、插入突變(2/51，3.9%)、調控位點突變(1/51，2.0%)和其他未知突變(5/51，9.8%)。本例突變未在NCBI數據庫及PubMed報道，為新發(fā)突變。

IMO主要臨床特征為貧血、肝脾腫大和視力障礙，不同基因型臨床特征見表3。

64例行造血干細胞移植，移植后死亡16例。死亡原因主要是移植失敗(4例，25%)、移植后并發(fā)癥(7例，43.7%)和感染(5例，31.3%)。

表2 TCIRG1基因突變情況

表3 嬰兒惡性石骨癥不同基因型的臨床特征

3 討論

IMO是一種以破骨細胞分化或功能異常為主要病變的遺傳性骨代謝異常綜合征[24]，為常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率約為1/250 000，是石骨癥中最嚴重的一種類型[25]。

IMO臨床癥狀缺乏特異性，確診依賴X線片檢查[26]，主要表現為全身廣泛均勻的骨密度增高，髓腔狹窄或閉塞[27]。本文患兒嬰兒期起病，臨床特點有方顱、眼球震顫、牙齒萌出延遲、佝僂病、肝脾腫大、貧血、腦積水和腦發(fā)育不良，X線片可見廣泛的骨密度增高、干骺端骨質破壞、“夾心椎”征象，符合IMO特征。

目前發(fā)現TCIRG1、CLCN7、OSTMI、RANK、RANKL和SNXIO基因參與IMO發(fā)病。IMO患者檢出的基因突變50.6%(39/77)為TCIRG1基因，其定位于11q13.2[9]，突變的類型主要包括錯義/無義、小片段的插入/缺失、剪切/調控位點改變等[29]。TCIRG1基因編碼液泡ATP酶(V-ATPase)a3亞基[30]。V-ATPase質子泵由介導ATP水解的細胞質水解結構域(V1)和促進細胞外酸化的跨膜質子易位結構域(V0)兩個主要區(qū)域組成[2,31]，在破骨細胞的皺褶緣表面高度表達[32]，主要功能是將氫離子泵出胞外以酸化細胞外環(huán)境，實現離子跨膜轉運，使鈣、磷從骨組織中釋放出來并沉著于類骨組織，形成新骨[33]，此過程對骨骼的重塑起重要作用[1]。當TCIRG1基因發(fā)生突變時，V-ATPase蛋白不能發(fā)揮正常功能，破骨細胞無法吸收舊骨，軟骨細胞鈣化堆積，導致骨質變密、硬脆，骨髓腔縮小、消失。臨床出現骨髓造血功能低下，引起肝、脾、淋巴結等髓外造血器官增大，長期貧血造成發(fā)育遲緩，體內鈣質無法正常代謝而出現佝僂病。因骨質硬化，骨小梁結構不良，易發(fā)生骨折和骨髓炎；顱骨硬化可出現方顱、腦積水等表現；顱神經受壓可導致視力障礙、眼球震顫、聽力障礙、面癱等。本文患兒父親和母親均攜帶雜合突變，分別為c.1360C>T(p.R454X)和c.722delC(p.T241fs)。結合患兒臨床特點，明確患兒為復合雜合突變導致的IMO。

Qin等[34]報道，V-ATP酶復合物的不同亞基的缺失影響破骨細胞功能，導致IMO。Lucia等[35]研究發(fā)現所有具有TCIRG1突變的常染色體隱性遺傳石骨癥(ARO)患者都表現出嚴重的表型，可能由于大多數TCIRG1突變完全破壞蛋白質的功能。但是檢測到少數僅有1個位點TCIRG1突變的患者與攜帶2個位點突變的患者有同樣嚴重的表型，提示可能存在其他未檢測到的突變。Sobacchi等[36]報道了1例臨床診斷為ARO的8歲女孩，影像學表現符合石骨癥，但沒有出現神經或血液學缺陷。基因檢測示TCIRG1基因純合突變(c.1941+5G>A)，導致產生多種異常轉錄物，但更重要的是，導致有限量的正常轉錄物，且這些低水平的正常TCIRG1蛋白可以減輕TCIRG1依賴性惡性ARO的臨床表現。這個結果揭示了溫和形式的TCIRG1-依賴性ARO的存在，為基因治療提供了思路。TCIRG1基因的轉錄本是單獨發(fā)揮作用還是被其他基因修飾？這種良性形式在接下來的幾年里是否會進展，發(fā)生諸如神經壓迫等并發(fā)癥？TCIRG1基因型與臨床表型的復雜相關性需要進一步研究。

CLCN7基因突變具有與TCIRG1基因突變致IMO相似的臨床表現，但CLCN7突變的IMO患兒表現有更多的發(fā)育遲緩和驚厥表型[37]。Aker等[38]發(fā)現SNX10基因突變致IMO病例的視力障礙、貧血和骨質脆化較為常見。Ott等[39]研究發(fā)現OSTM1基因可引起非常嚴重的疾病表型，伴有頻繁的中樞神經系統(tǒng)表現。RANK和RANKL屬于腫瘤壞死因子配體超家族成員，其突變通過影響破骨細胞的分化使破骨細胞數目大幅度減少，導致IMO[40]。本文文獻復習發(fā)現77例行基因檢測的IMO患兒中，國內19例全部為TCIRG1基因突變，而國外各基因型均有報道，推測可能是不同種族的遺傳背景及地域環(huán)境的差異所致。

IMO發(fā)病早、進展快、預后差，大部分患兒于6歲內死亡。造血干細胞移植(HSCT)是根治IMO的唯一方法，然而，由于HSCT無法改善已有的神經系統(tǒng)后遺癥[41]，盡早獲得HLA基因型相合的供者是移植成功的關鍵。隨著生殖醫(yī)學的發(fā)展，采用體外受精并在胚胎移植前行遺傳學診斷已成為避免家族性遺傳病傳至下一代的有效手段。本研究對1例IMO患兒進行突變篩查，檢測到TCIRG1基因2個突變，豐富了石骨癥的致病突變譜，為產前診斷學基因芯片提供了新的數據。