高密度CO2處理過程中蝦肌球蛋白分子間作用力的變化

劉書成，郭明慧，劉 媛，吉宏武，高 靜，毛偉杰，鄧楚津，郝記明，羅 帥，董安迪

凝膠特性是蛋白質(zhì)重要的功能特性之一。蛋白質(zhì)形成凝膠可分為兩步：變性和聚集[1]。在外界因素（熱、酸、鹽、高壓等）作用下，蛋白質(zhì)首先發(fā)生變性，使維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的分子間作用力（氫鍵、離子鍵、疏水相互作用、二硫鍵、非二硫共價鍵等）被破壞，基團被暴露；接著，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和分子間的相互作用，形成了新的分子間作用力，可穩(wěn)定凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。因此，分子間作用力在蛋白質(zhì)形成凝膠的不同階段，其作用是不同的。研究蛋白質(zhì)形成凝膠過程中分子間作用力的變化，可為探討蛋白質(zhì)形成凝膠的機理奠定基礎(chǔ)。

高密度CO2（dense phase carbon dioxide，DPCD）是一種非熱食品加工技術(shù)，它是將壓力和二氧化碳結(jié)合，形成高壓高酸性環(huán)境，實現(xiàn)對食品的殺菌和鈍酶；它能在保證食品安全的同時，最小程度影響食品的原有風(fēng)味、色澤、滋味、質(zhì)構(gòu)等[3-6]。DPCD最初主要用于液體食品（果汁、牛乳和啤酒等）的殺菌和鈍酶[3-6]。近年來國內(nèi)外的研究表明：DPCD對固體食品（肉及肉制品、海洋食品、鮮切果蔬等）同樣具有較好的殺菌和鈍酶效果[7-10]，而且可以改善蛋白質(zhì)的功能特性[11-13]、誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性以制備凝膠制品[14-18]。

本課題組前期研究表明，DPCD能夠誘導(dǎo)凡納濱對蝦肉糜形成凝膠，而且制備凝膠的微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性顯著優(yōu)于熱誘導(dǎo)的[18]。關(guān)于蛋白質(zhì)形成凝膠過程中分子間作用力的變化，目前國內(nèi)外研究主要集中在熱、鹽、超高壓等處理方面[19]，而DPCD誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠過程分子間作用力的變化鮮見相關(guān)報道。雖然不同的外界因素均可以使蛋白質(zhì)形成凝膠，但是其形成的機制是不同的[19]。本實驗以凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）肌球蛋白為對象，研究DPCD誘導(dǎo)肌球蛋白形成凝膠過程中分子間作用力的變化，為闡明DPCD誘導(dǎo)蝦肉糜形成凝膠的機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為利用DPCD技術(shù)開發(fā)肉糜類凝膠制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），50～60 尾/kg，購于湛江市霞山區(qū)東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場，用保溫箱帶水?；钸\至實驗室（運輸時間1 h左右），用自來水清洗干凈后，用冰猝死，去頭去殼去腸腺，取蝦肉待用。藥用小量杯（口服杯），購于汕頭市金平區(qū)迅能得化工店。

Lowry法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒 上海荔達生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 廣州齊云生物技術(shù)有限公司；CO2（純度99.9%） 湛江氧氣廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HA221-50-10-C型超臨界裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；UX2200H電子天平、AUY220型分析天平、UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PHS-25數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

肌球蛋白的提取參考文獻[20]的方法，新鮮蝦肉攪碎后，按料液比1∶5（m/V）加入20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），均質(zhì)后5 500×g離心10 min，取沉淀再重復(fù)上述過程2 次。按1∶3（m/V）的比例向所得沉淀中加入提取液（0.45 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7.5 mmol/L MgCl2、0.15 mmol/L二硫蘇糖醇，pH 6.4）攪拌15 min后10 000×g離心10 min。4 層紗布過濾后，取濾液與9 倍體積的預(yù)冷蒸餾水混合靜置10 min，6 000×g離心10 min得沉淀。按5∶1（m/V）的比例向沉淀中加入3 mol/L KCl-0.6 mmol/L二硫蘇糖醇-0.12 mol/L Tris-Maleate緩沖液（pH 7.5），于4 ℃靜置過夜，按5∶1（m/V）的比例加入0.11 mol/L ATP-55 mmol/L MgCl2-5.5 mmol/L EGTA溶液（pH 7.5）后，于4 ℃靜置2 h。加入飽和硫酸銨溶液，采用飽和度為40%～45%的硫酸銨來分離純化肌球蛋白。離心后將沉淀置于0.6 mol/L KCl-20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中透析至無SO42-檢出，期間更換透析液。整個過程中，溶液保持在4 ℃條件下。將透析后的溶液離心，上清液即為凡納濱對蝦肌球蛋白溶液。采用改良Lowery法[14]測定蛋白質(zhì)含量為12～16 mg/mL。

1.3.2 高密度CO2處理和實驗設(shè)計

間歇式DPCD處理流程參考文獻[21]的方法。實驗參數(shù)的設(shè)置依據(jù)前期實驗而定。將肌球蛋白溶液稀釋或濃縮至14 mg/mL，取5 mL肌球蛋白溶液于10 mL藥用小量杯中，進行間歇式DPCD處理20 min，然后測定其分子間作用力。采用雙因素等重復(fù)試驗設(shè)計，處理溫度水平為40、50、60 ℃，處理壓強水平為5、10、15、25 MPa。設(shè)置3 個對照組：未處理蝦肉糜（C1）：稱取2 g蝦肉糜，用于化學(xué)作用力測定；水浴熱處理組（C2）：將肌球蛋白溶液稀釋至14 mg/mL，取5 mL肌球蛋白溶液溶于10 mL藥用小量杯中，放置于水浴中處理20 min，然后測定其化學(xué)作用力，水浴溫度水平為40、50、60 ℃；常壓CO2組（C3）：將肌球蛋白溶液稀釋至14 mg/mL，取5 mL肌球蛋白溶液溶于10 mL藥用小量杯中，放置于間歇式DPCD設(shè)備中，充入CO2，但壓強為0.1 MPa，處理20 min，然后測定其分子間作用力。

1.3.3 分子間作用力的測定

參照Tan等[22]方法。將2 g樣品加10 mL S1提取液（0.6 mol/L NaCl），5 000 r/min勻漿5 min，4 ℃放置1 h，4 ℃、18 600×g離心25 min，上清液于4 ℃保存。向上述離心的沉淀加10 mL S2提取液（1.5 mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl），3 700 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，4 ℃、18 600×g離心25 min，上清液4 ℃保存。向上述離心沉淀加10 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液）提取液，5 000 r/min勻漿5 min，于4 ℃放置1 h，4 ℃、18 600×g離心25 min，上清液4 ℃保存（重復(fù)2 次）。向上述離心沉淀加10 mL S4提取液（0.5 mol/L β-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl、8 mol/L尿素，pH 7），5 000 r/min勻漿5 min，4 ℃放置1 h，4 ℃、18 600×g離心25 min，上清液4 ℃保存。經(jīng)S4液提取后離心得沉淀，加1 mL 1 mol/L NaOH溶液，4 ℃保存。上述各步離心后所得上清液分別加入等體積（5 mL）20%三氯乙酸，3 950×g離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液于4 ℃放置，采用改良Lowry法[14]測定其蛋白質(zhì)含量。離子鍵的貢獻以溶解于S1的蛋白質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示，氫鍵的貢獻以溶解于S2的蛋白質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示，疏水相互作用的貢獻以溶解于S3的蛋白質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示，二硫鍵的貢獻以溶解于S4的蛋白質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示，非二硫共價鍵的貢獻以經(jīng)S4液提取后最終沉淀的蛋白相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用 ±s表示；用JMP 10.0軟件進行方差分析和Tukey’s HSD多重比較及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫鍵的變化

從圖1可以看出，未處理蝦肉糜的氫鍵的貢獻（以蛋白相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)計）為（20.73±0.80）%。與未處理組相比，水浴熱處理、常壓CO2處理和DPCD處理都顯著降低了肌球蛋白的氫鍵貢獻（P＜0.05），說明3 種處理方式均能使肌球蛋白的氫鍵斷裂。在40 ℃處理，水浴熱處理的肌球蛋白氫鍵貢獻顯著低于常壓CO2處理的（P＜0.05），這是由于CO2溶于水形成弱酸碳酸，對氫鍵具有一定的穩(wěn)定作用[23]；DPCD處理的肌球蛋白氫鍵貢獻顯著低于水浴熱處理和常壓CO2處理的（P＜0.05），這是因為高壓CO2的pH值降低效應(yīng)和分子效應(yīng)使肌球蛋白發(fā)生變性[3]，從而造成一些氫鍵斷裂。在50、60 ℃下處理，水浴熱處理、常壓CO2處理與DPCD處理的肌球蛋白氫鍵貢獻之間無顯著差異（P＞0.05），說明50 ℃以上的熱效應(yīng)已經(jīng)能對氫鍵產(chǎn)生強烈的破壞，因為氫鍵對溫度是比較敏感的，溫度越高，氫鍵越弱[23]。

圖1 DPCD處理過程中蝦肌球蛋白氫鍵的變化Fig. 1 Change in hydrogen bond of myosin from Litopenaeus vannamei treated by DPCD

從圖1還可以看出，對于水浴熱處理和常壓CO2處理組，溫度從40 ℃升高50 ℃，肌球蛋白氫鍵貢獻顯著下降（P＜0.05），而溫度從50 ℃升高到60 ℃，肌球蛋白氫鍵貢獻無顯著變化（P＞0.05）。這主要是因為凡納濱對蝦肌球蛋白的變性溫度為42.8 ℃[24]，超過變性溫度，肌球蛋白因發(fā)生變性而使氫鍵貢獻變化不大。對于DPCD處理組，壓強和溫度的升高對肌球蛋白的氫鍵貢獻均無顯著影響（P＞0.05），這可能是因為低強度的DPCD處理（5 MPa、40 ℃）即可使肌球蛋白發(fā)生變性[25]，已經(jīng)破壞了大量氫鍵，而使其含量維持在一定水平。

在熱誘導(dǎo)肌球蛋白形成凝膠過程中，當(dāng)肌球蛋白高溫受熱變性時，大量氫鍵發(fā)生斷裂且α-螺旋解旋，冷卻后又會形成新的氫鍵起到穩(wěn)定凝膠的作用[2]。鄧麗等[26]研究熱誘導(dǎo)鮑魚腹足蛋白分子間作用力的變化，發(fā)現(xiàn)在60 ℃左右氫鍵貢獻下降，再升高溫度其氫鍵貢獻變化不顯著。劉海梅等[27]研究從40 ℃到90 ℃鰱魚糜的凝膠化，發(fā)現(xiàn)氫鍵貢獻也是降低的，并且認(rèn)為氫鍵不是維持其凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力。李杰等[28]研究草魚魚糜的凝膠化，發(fā)現(xiàn)氫鍵貢獻也是下降的。Tan等[22]在50 ℃和60 ℃處理羅非魚魚糜凝膠，發(fā)現(xiàn)氫鍵貢獻顯著低于40 ℃處理的。許艷順[29]研究發(fā)酵鰱魚糜的凝膠化過程，發(fā)現(xiàn)隨著pH值降低（由6.3降至4.3）氫鍵貢獻下降，并認(rèn)為氫鍵不是維持發(fā)酵魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)作用力。這些均與本研究的結(jié)果一致。從本研究來看，低強度的DPCD處理就能破壞肌球蛋白的大量氫鍵，但隨壓力和溫度升高，氫鍵貢獻一直維持在較低水平，因此氫鍵不是DPCD誘導(dǎo)蝦肌球蛋白形成凝膠過程中的主要分子間作用力。

2.2 離子鍵的變化

在魚糜（接近中性）正常pH值下，離子鍵是維持肌原纖維蛋白天然結(jié)構(gòu)的主要作用力，但是在外界因素（熱、鹽、高壓等）作用下可以破壞蛋白質(zhì)分子間的離子鍵，而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和凝膠化[2]。

圖2 DPCD處理過程中蝦肌球蛋白離子鍵的變化Fig. 2 Change in ionic bond of myosin from Litopenaeus vannamei treated by DPCD

從圖2可以看出，未處理蝦肉糜的離子鍵的貢獻（以蛋白相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)計）為（10.87±1.24）%。與未處理組相比，40 ℃和50 ℃的水浴熱處理對肌球蛋白的離子鍵貢獻無顯著影響（P＞0.05），可能是因為40 ℃和50 ℃的熱能還不足以破壞蛋白質(zhì)分子之間的離子鍵；而60 ℃的水浴熱處理使肌球蛋白離子鍵貢獻顯著增加（P＜0.05）。正常情況下加熱會破壞蛋白質(zhì)分子間的離子鍵，但是由于提取肌球蛋白時使用了KCl和NaCl等鹽類，60 ℃的熱能可能破壞蛋白質(zhì)分子之間的離子鍵，但同時可能形成了新的離子鍵[2]。與未處理組相比，常壓CO2處理對肌球蛋白的離子鍵貢獻無顯著影響（P＞0.05），這可能是常壓CO2溶解于水中形成少量碳酸的緩沖作用。與3 個對照組相比，DPCD處理能顯著降低肌球蛋白的離子鍵貢獻（P＜0.05），這可是因為壓強下CO2的pH值降低效應(yīng)和分子效應(yīng)[3]破壞了蛋白質(zhì)分子之間和蛋白質(zhì)與鹽離子之間的離子鍵。

從圖2還可以看出，在相同DPCD處理溫度下，壓強對肌球蛋白的離子鍵貢獻無顯著影響（P＞0.05），這可能因為5 MPa下DPCD處理已使肌球蛋白發(fā)生變性[25]，已經(jīng)破壞了部分離子鍵，而使其貢獻維持在一定水平；在相同DPCD處理壓強下，溫度從40 ℃升到50 ℃，肌球蛋白離子鍵貢獻顯著降低（P＜0.05），而溫度從50 ℃升到60 ℃，肌球蛋白離子鍵貢獻又顯著升高（P＜0.05）。因為DPCD誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠是pH值效應(yīng)和熱效應(yīng)共同作用的[14-18]。DPCD溶于水降低體系pH值，通過調(diào)節(jié)pH值影響蛋白質(zhì)的離子化作用和凈電荷值，另一方面熱效應(yīng)可以破壞離子鍵[30-31]。因此，在固定壓強下，與未處理的相比，由于40 ℃的DPCD使肌球蛋白溶液pH值降低接近于等電點，而使離子鍵貢獻降低；溫度從40 ℃升高到50 ℃（凡納濱對蝦肌球蛋白的變性溫度為42.8 ℃[24]），體系的pH值變化較小，而此時熱效應(yīng)加劇，使離子鍵貢獻繼續(xù)下降；當(dāng)溫度升高到60 ℃時，體系pH值升高，此時熱效應(yīng)對離子鍵的影響較小，而使離子鍵的貢獻又升高。

鄧麗等[26]研究熱誘導(dǎo)鮑魚腹足蛋白分子間作用力的變化，發(fā)現(xiàn)在60 ℃左右離子鍵貢獻下降，再升高溫度其離子鍵貢獻變化不顯著。劉海梅等[27]研究40～90 ℃鰱魚糜的凝膠化，發(fā)現(xiàn)離子鍵貢獻是降低的，并且認(rèn)為離子鍵不是維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要分子間作用力。許艷順[29]研究發(fā)酵鰱魚糜的凝膠化過程，發(fā)現(xiàn)隨著pH值從6.3降到4.3，離子鍵貢獻是下降的，認(rèn)為離子鍵不是維持發(fā)酵魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)作用力。這些與本研究的結(jié)果一致。從本研究來看，DPCD處理總體上是破壞了肌球蛋白的離子鍵，因此離子鍵也不是DPCD誘導(dǎo)蝦肌球蛋白形成凝膠過程中的主要分子間作用力。

2.3 疏水相互作用的變化

天然蛋白質(zhì)在外界因素（加熱、高壓、離子等）作用下，疏水基團會暴露于分子表面，相鄰蛋白質(zhì)的疏水部分發(fā)生緊密結(jié)合，就產(chǎn)生了疏水相互作用，引起蛋白質(zhì)凝集，在合適條件下便可以形成凝膠[2]。通過加熱可以增加蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用[2]。蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用的形成被認(rèn)為是加熱或高壓（＞300 MPa）誘導(dǎo)魚糜形成凝膠的主要機制之一[32]。

圖3 DPCD處理過程中蝦肌球蛋白疏水相互作用的變化Fig. 3 Change in hydrophobic interaction of myosin from Litopenaeus vannamei treated by DPCD

從圖3可以看出，未處理蝦肉糜的疏水相互作用的貢獻（以蛋白相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)計）為（43.96±0.38）%。與未處理組相比，水浴熱處理、常壓CO2處理和DPCD處理均能顯著增加肌球蛋白的疏水相互作用（P＜0.05）。在40 ℃下處理，常壓CO2處理的肌球蛋白的疏水相互作用顯著高于水浴熱處理的（P＜0.05），而DPCD處理的又顯著高于水浴熱處理的和常壓CO2處理的（P＜0.05）。這可能是因為40 ℃的熱效應(yīng)能緩慢使肌球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化，疏水基團逐漸暴露出來，有利于疏水相互作用的增加[2]；由于CO2是非極性的，能促進蛋白質(zhì)分子之間疏水相互作用的形成，壓強下的CO2在水中的溶解度更大一些，其作用也更強烈一些。在50 ℃下處理，水浴熱處理和常壓CO2處理的肌球蛋白的疏水相互作用無顯著差異（P＞0.05），這可能是常壓CO2在50 ℃下的非極性作用低于其熱效應(yīng)；DPCD處理的則顯著高于水浴熱處理和常壓CO2處理的（P＜0.05），主要是因為DPCD處理能夠使肌球蛋白發(fā)生變性，使其疏水基團充分暴露出來，從而增強了疏水相互作用[33]。在60 ℃下處理，水浴熱處理、常壓CO2處理和DPCD處理的肌球蛋白的疏水相互作用無顯著差異（P＞0.05），可能是60 ℃的熱效應(yīng)已能使肌球蛋白充分變性伸展，使疏水基團暴露，增強了疏水相互作用[26-28]。在相同的DPCD處理溫度下，壓強對肌球蛋白的疏水相互作用無顯著影響（P＞0.05），說明低壓強（5 MPa）即可使肌球蛋白發(fā)生較大程度的變性，使疏水基團暴露，增強了疏水相互作用[33]。

從圖3還可以看出，隨著處理溫度升高，水浴熱處理的肌球蛋白的疏水相互作用有增加趨勢（P＜0.05），因為溫度升高，蛋白變性程度增加，更多疏水基團暴露出來，有利于疏水相互作用的形成。溫度對常壓CO2處理的肌球蛋白的疏水相互作用無顯著影響（P＞0.05），雖然溫度升高有利于疏水相互作用的形成，CO2也能夠促進疏水相互作用的形成，但常壓下升高溫度，CO2在水中的溶解度降低，使在高溫下體現(xiàn)不出CO2的作用。在相同壓強下，40 ℃和50 ℃的DPCD處理，肌球蛋白的疏水相互作用無顯著差異（P＞0.05），而當(dāng)溫度升高到60 ℃時，疏水相互作用顯著下降（P＜0.05）。因為在DPCD處理條件下體系處于酸性環(huán)境，在酸性環(huán)境下隨著處理溫度升高，蛋白質(zhì)的疏水相互作用會減弱[30]。

鄧麗等[26]研究熱誘導(dǎo)鮑魚腹足蛋白分子間作用力的變化，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用呈先升高后下降的趨勢。劉海梅等[27]研究40 ℃到90 ℃鰱魚糜的凝膠化，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用是增加的，并且認(rèn)為疏水相互作用是維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力之一。李杰等[28]研究熱誘導(dǎo)草魚魚糜的凝膠化過程，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用也是增加的。Tan等[22]熱處理羅非魚魚糜，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用在40～60 ℃范圍內(nèi)呈增加趨勢。這都與本研究的結(jié)果一致。從本研究來看，DPCD處理能夠顯著增加肌球蛋白分子間的疏水相互作用，而且其含量較高，因此疏水相互作用是DPCD誘導(dǎo)蝦肌球蛋白形成凝膠過程中的主要分子間作用力。

2.4 二硫鍵的變化

分子間二硫鍵是通過相鄰蛋白質(zhì)肽鏈上具有反應(yīng)活性巰基（—SH）基團的兩個半胱氨酸分子的氧化形成的，它是熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠的主要共價鍵[2]。

圖4 DPCD處理過程中蝦肌球蛋白二硫鍵的變化Fig. 4 Change in disulfide bond of myosin from Litopenaeus vannamei treated by DPCD

從圖4可以看出，未處理蝦肉糜的二硫鍵的貢獻（以蛋白相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)計）為（11.84±1.01）%。與未處理組相比，水浴熱處理和DPCD處理均能顯著增加肌球蛋白的二硫鍵貢獻（P＜0.05），而40 ℃和50 ℃下DPCD處理又顯著高于水浴熱處理的（P＜0.05）。水浴熱處理主要是熱效應(yīng)促進了位于蛋白質(zhì)表面的活性巰基氧化形成二硫鍵[2]，而DPCD處理同時具有熱效應(yīng)和CO2的分子效應(yīng)[3]，能使蛋白質(zhì)充分變性伸展，暴露出更多活性巰基，從而形成了較多的二硫鍵。與未處理組相比，40 ℃、常壓CO2處理對肌球蛋白的二硫鍵貢獻無顯著影響（P＞0.05），因為常壓CO2溶于水形成碳酸，具有緩沖保護作用；50 ℃和60 ℃的常壓CO2處理都顯著增加了肌球蛋白的二硫鍵貢獻（P＜0.05），這可能是熱效應(yīng)促進了活性巰基的氧化作用[2]，而且溫度升高使CO2溶解度降低，失去了緩沖保護作用。在60 ℃下，水浴熱處理、常壓CO2處理和DPCD處理的肌球蛋白的二硫鍵貢獻無顯著差異（P＞0.05），這可能是因為肌球蛋白中含有的活性巰基是一定量的，在60 ℃熱效應(yīng)作用下即可形成穩(wěn)定數(shù)量的二硫鍵[2]。從圖4還可以看出，對于DPCD處理，壓強和溫度對二硫鍵貢獻均無顯著影響（P＞0.05），這可能是低強度的DPCD處理（5 MPa、40 ℃）即可使肌球蛋白發(fā)生變性[25,33]，活性巰基充分暴露而氧化成二硫鍵，而使其含量維持在一定水平。

鄧麗等[26]研究熱誘導(dǎo)鮑魚腹足蛋白分子間作用力的變化，發(fā)現(xiàn)二硫鍵貢獻是增加的。劉海梅等[27]研究40～90 ℃鰱魚糜的凝膠化，發(fā)現(xiàn)二硫鍵貢獻也是增加的。Tan等[22]在30～70 ℃范圍內(nèi)處理羅非魚魚糜，隨著溫度升高，二硫鍵貢獻先增加后降低，在50 ℃時二硫鍵最高。這都與本研究的結(jié)果一致。從本研究來看，DPCD處理能夠顯著增加肌球蛋白分子的二硫鍵，而且含量較高，因此二硫鍵是DPCD誘導(dǎo)蝦肌球蛋白形成凝膠過程中的主要分子間作用力。

2.5 非二硫共價鍵的變化

非二硫共價鍵在蛋白質(zhì)形成凝膠過程中也具有重要的作用[2]。從圖5可以看出，未處理蝦肉糜的非二硫共價鍵的貢獻（以蛋白相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)計）為（12.68±1.79）%。與未處理組相比，40 ℃水浴熱處理和常壓CO2處理對非二硫共價鍵貢獻無顯著影響（P＞0.05），但DPCD處理能顯著增加非二硫共價鍵貢獻（P＜0.05）。這可能是40 ℃的熱效應(yīng)不足以引起肌球蛋白的非二硫共價鍵貢獻的變化，而壓強下CO2的pH值降低效應(yīng)和分子效應(yīng)能夠使肌球蛋白形成新的非二硫共價鍵。與未處理組相比，50 ℃和60 ℃的水浴熱處理、常壓CO2處理和DPCD處理均能顯著增加肌球蛋白的非二硫共價鍵貢獻（P＜0.05），但水浴熱處理與常壓CO2處理組之間無顯著差異（P＞0.05），DPCD處理的顯著高于水浴熱處理與常壓CO2處理組的（P＜0.05）。這可能是50 ℃和60 ℃的熱效應(yīng)能使肌球蛋白形成新的非二硫共價鍵，而DPCD處理同時具有熱效應(yīng)和CO2分子效應(yīng)，雙重作用使肌球蛋白形成了更多的非二硫共價鍵。從圖5還可以看出，在相同DPCD處理溫度下，壓強對非二硫共價鍵貢獻無顯著影響（P＞0.05）。這可能是低壓強（5 MPa）處理，CO2的分子效應(yīng)即可使肌球蛋白形成更多的非二硫共價鍵；隨著處理溫度升高，水浴熱處理、常壓CO2處理和DPCD處理的肌球蛋白的非二硫共價鍵貢獻均有增加趨勢（P＜0.05），這可能是隨著熱能增加，分子運動加劇，形成了數(shù)量比較多的新共價鍵。

圖5 DPCD處理過程中蝦肌球蛋白非二硫共價鍵的變化Fig. 5 Change in non-disulfide covalent bond of myosin from Litopenaeus vannamei treated by DPCD

鄧麗等[26]研究熱誘導(dǎo)鮑魚腹足蛋白分子間作用力的變化，發(fā)現(xiàn)非二硫共價鍵貢獻是增加的。劉海梅等[27]研究40～90 ℃鰱魚糜的凝膠化，發(fā)現(xiàn)非二硫共價鍵貢獻也是增加的，而且認(rèn)為非二硫共價鍵是維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力之一。李杰等[28]研究草魚魚糜熱誘導(dǎo)凝膠化，發(fā)現(xiàn)凝膠化魚糜過程中形成了非二硫共價鍵，而且認(rèn)為非二硫共價鍵參與了魚糜凝膠化過程和魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。Tan等[22]發(fā)現(xiàn)羅非魚魚糜隨著溫度（30～70 ℃）的增加，非二硫共價鍵貢獻是增加的。許艷順等[29]研究發(fā)酵鰱魚糜凝膠形成作用力的變化，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間從0 h延長到48 h（pH值逐漸減小），非二硫共價鍵貢獻逐漸增加。因此，非二硫共價鍵不僅參與蛋白質(zhì)凝膠化過程，而且對穩(wěn)定蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是具有一定貢獻的。這些都與本研究的結(jié)果一致。從本研究來看，DPCD處理能夠顯著增加肌球蛋白分子的非二硫共價鍵，而且貢獻較高，因此非二硫共價鍵是DPCD誘導(dǎo)蝦肌球蛋白形成凝膠過程中的主要分子間作用力。

2.6 分子間作用力的貢獻

分子間作用力在蛋白質(zhì)凝膠形成、維持凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及保持凝膠優(yōu)良質(zhì)構(gòu)等方面具有重要的作用，然而在蛋白質(zhì)形成凝膠的不同階段、不同方式誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)凝膠、不同來源蛋白質(zhì)形成的凝膠，各分子間作用力的貢獻是有差異的。從圖1～5可以看出，從分子間作用力的貢獻角度分析，未處理蝦肉糜的各分子間作用力貢獻的大小順序依次為疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵、非二硫共價鍵和離子鍵，其中后三者的貢獻接近；蝦肌球蛋白經(jīng)DPCD處理后，各分子間作用力貢獻的大小順序依次為疏水相互作用、二硫鍵、非二硫共價鍵、離子鍵和氫鍵。因此，疏水相互作用和氫鍵對維持蝦肉糜中肌球蛋白的天然結(jié)構(gòu)具有重要作用，而蝦肌球蛋白經(jīng)過DPCD處理后，氫鍵和離子鍵被破壞，促進了疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵的形成。董秋穎等[34]從質(zhì)構(gòu)學(xué)角度研究雞肉肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠形成的作用力，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用在凝膠形成中具有顯著作用，氫鍵也具有重要作用，二硫鍵對凝膠形成的影響不大。張小燕等[35]研究分子間作用力對超高壓誘導(dǎo)豬肉凝膠強度的影響，發(fā)現(xiàn)氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵對凝膠強度影響顯著，離子鍵對凝膠強度影響較小。Abdelhedi等[31]研究熱誘導(dǎo)鯊魚內(nèi)臟蛋白形成凝膠，發(fā)現(xiàn)二硫鍵、疏水相互作用和氫鍵在凝膠形成過程中具有重要作用。比較這些研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用在各種蛋白質(zhì)形成凝膠過程中均具有重要作用，而其他分子間作用力的貢獻則存在差異，這是因為蛋白質(zhì)來源不同，其氨基酸組成和高級結(jié)構(gòu)存在較大差異[36]，還可能是因為不同的處理方式對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的破壞程度存在差異[19]。

2.7 壓力和溫度的協(xié)同效應(yīng)

對圖1～5中的數(shù)據(jù)進行雙因素等重復(fù)方差分析表明，DPCD處理壓力和溫度之間的交互作用是顯著的（P＜0.05）。這說明DPCD處理壓力和溫度之間存在一定的協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)DPCD處理肌球蛋白溶液時，CO2溶解于水中形成碳酸，再解離為碳酸氫根離子、碳酸根離子和氫離子，從而使體系的pH值降低[3]。一般來說，壓力越高，CO2在溶液中的溶解度就越大，體系的pH值就越低。雖然溫度升高，CO2在溶液中的溶解度降低，體系的pH值可能稍有增加，但是單純的熱效應(yīng)也能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠。pH值是通過改變蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的解離狀態(tài)和電荷分布，從而對凝膠形成和維持凝膠結(jié)構(gòu)的作用力產(chǎn)生影響[30-31,36]。加熱主要提供熱能破壞維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的作用力，蛋白質(zhì)在變性再聚集過程中又形成了新的分子間作用力[2]。因此，DPCD誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠也是pH值效應(yīng)、CO2分子效應(yīng)和熱效應(yīng)共同作用的結(jié)果。

3 結(jié) 論

以未處理的蝦肉糜、水浴熱處理和常壓CO2處理的肌球蛋白為對照，研究了DPCD誘導(dǎo)凡納濱對蝦肌球蛋白形成凝膠過程中分子間作用力的變化，結(jié)論如下：1）與未處理的蝦肉糜相比，DPCD處理能使肌球蛋白的氫鍵和離子鍵貢獻降低（P＜0.05），而使疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵的貢獻增加（P＜0.05）；在相同DPCD處理溫度下，壓強（5～25 MPa）對肌球蛋白分子間作用力無顯著影響（P＞0.05）；在相同DPCD處理壓強下，隨著溫度（40～60 ℃）升高，氫鍵和二硫鍵貢獻無顯著變化（P＞0.05），非二硫共價鍵貢獻呈增加趨勢（P＜0.05），疏水相互作用呈降低趨勢（P＜0.05），離子鍵貢獻則先降低后升高（P＜0.05）。2）DPCD對分子間作用力的影響是壓力和溫度協(xié)同作用的結(jié)果。疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵是DPCD誘導(dǎo)肌球蛋白形成凝膠過程中的主要分子間作用力，而氫鍵和離子鍵不是其主要分子間作用力。

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