溫州蜜柑和冰糖橙果實表面角質(zhì)層組分及微觀結(jié)構(gòu)差異分析

張 靜，丁勝華,,*，謝秋濤，付復(fù)華，王蓉蓉，李高陽,，單 楊,,*

幾乎所有的陸生植物表面都覆蓋著一層角質(zhì)層，作為與外界環(huán)境的介質(zhì)，角質(zhì)層具有防止非氣孔性水分損失、保持表面干凈[1]、抵御微生物和昆蟲入侵[2]等重要生理功能。角質(zhì)層由表皮角質(zhì)膜層和可溶性蠟質(zhì)層構(gòu)成。角質(zhì)膜層是由羥基脂肪酸和環(huán)氧脂肪酸組成的聚酯化合物，是角質(zhì)層的骨架結(jié)構(gòu)。蠟質(zhì)層主要由特長鏈（C20～C34）飽和脂肪酸及其衍生物（烴、醛、醇、酯等）、萜類物質(zhì)和其他微量次生代謝物（固醇及類黃酮類等）組成。植物蠟質(zhì)層又可分為兩層，填充于角質(zhì)膜層內(nèi)的叫內(nèi)蠟，覆蓋在角質(zhì)膜層表面并具有自組裝能力的叫外蠟。植物表皮角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)和組成成分決定了其不同的功能。植物果實表面蠟質(zhì)含量、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成成分受品種、成熟期以及栽培環(huán)境等因素影響[3-4]，并且對其失水率[5]、氣體交換率[6-7]、冷藏過程中受到的冷害影響很大[8]。果實表皮角質(zhì)層在果實采后貯藏品質(zhì)變化中起著重要的調(diào)控作用[9]。李宏鍵等[10]發(fā)現(xiàn)，具有厚且均勻致密的角質(zhì)層的蘋果品種，其采后硬度和質(zhì)量損失率變化較小。郜海燕等[11]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓的外表皮蠟質(zhì)受損后更容易發(fā)生軟化、衰老現(xiàn)象。Naziri等[12]報道由野生型酵母代謝產(chǎn)生的角鯊烯能夠作為一種安全的化學(xué)物質(zhì)來清除氧自由基，推遲水果的衰亡。

柑橘作為第一大世界水果，2014年在我國的產(chǎn)量為3 020萬 t，占全球產(chǎn)量的33.3%，居世界首位，其中，2014年我國寬皮柑橘和甜橙產(chǎn)量分別達(dá)1 940萬 t和690萬 t[13]。關(guān)于柑橘角質(zhì)層的研究報道主要集中在紐荷爾臍橙及其突變體和果實在采前生長過程中的蠟質(zhì)變化。Liu Dechun等[14]對野生型和突變型紐荷爾臍橙生長過程中蠟質(zhì)成分和含量變化以及相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)合成和運輸基因的表達(dá)下調(diào)伴隨著脂肪族物質(zhì)含量的減少和外蠟晶體的損失，從而導(dǎo)致了突變體紐荷爾臍橙的光滑表型。Wang Jinqiu等[15]對紐荷爾臍橙生長和成熟過程中角質(zhì)層的形成進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，結(jié)果表明角質(zhì)膜層的積累與果實的生長同步，而蠟質(zhì)的合成與果實的成熟過程同步。溫州蜜柑（Citrus unshiu Marc.）和冰糖橙（Citrus sinensis Osbeck）分別為寬皮柑橘和緊皮柑橘典型品種的代表，同時也是湖南省的主栽柑橘品種。溫州蜜柑和冰糖橙在貯藏過程中易失水，且失水率存在不同，這可能與其表面角質(zhì)層組分及微觀結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。然而到目前為止，鮮有關(guān)于溫州蜜柑和冰糖橙表面角質(zhì)層組分及微觀結(jié)構(gòu)差異的報道。因此，本研究以溫州蜜柑、冰糖橙的果實為研究對象，探究其角質(zhì)層組成成分、晶體形態(tài)結(jié)構(gòu)以及內(nèi)外角質(zhì)層蠟質(zhì)分布的差異，為明確不同柑橘品種的貯藏特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以果面光潔、無機械損傷、大小均一、成熟新鮮的溫州蜜柑（2016年10月10日采自湖南省石門市）、冰糖橙（2016年11月25日采自湖南省永州市）果實為實驗材料。

正構(gòu)二十四烷（色譜純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；14%三氟化硼-甲醇溶液 CNW（上海）安譜實驗科技股份有限公司；N,O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N,O-bis(trimethylsilyl trifluoroacetamid), BSTFA）美國Sigma-Aldrich公司；纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶上海瑞海生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-25C冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；Organomation氮吹儀 銘奧國際有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）儀 安捷倫科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；EDT-2000型離子濺射儀、EVO/LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 果實蠟質(zhì)成分提取與測定

蠟質(zhì)層提取實驗的步驟為：分別選取30 個溫州蜜柑和冰糖橙果實，分3 次重復(fù)，每個重復(fù)10個果實。參考Liu Dechun等[14]的方法分別提取外蠟和內(nèi)蠟，并略作修改。提取外蠟時，將2 次獲得的阿拉伯膠用蒸餾水溶解，并在室溫下用3 倍體積的三氯甲烷抽提。最后分別加入200 μL的正構(gòu)二十四烷（1 μg/μL）為內(nèi)標(biāo)，在氮氣下吹干，貯存于-20 ℃，待測。

蠟質(zhì)層成分測定的步驟為：向每個樣品中加入一定體積的吡啶，50 ℃于烘箱中保持30 min，加入等體積的BSTFA，60 ℃衍生40 min。氮氣吹干多余的衍生化試劑后重新溶于5 mL氯仿中，用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾，用于GC-MS分析。采用HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），色譜條件為：進(jìn)樣口溫度280 ℃，質(zhì)譜源溫度230 ℃，柱流速2 mL/min，恒定流速；Aux-2溫度280 ℃，載氣為氦氣，無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件為：電子轟電離方式，能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～600 amu，全掃描方式，溶劑延遲8 min。升溫過程為70 ℃保持1 min，以20 ℃/min升溫至200 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升溫至320 ℃，保持20 min。各種蠟質(zhì)成分經(jīng)GC-MS檢測后得到其離子峰，依據(jù)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索判定，并與內(nèi)標(biāo)比較進(jìn)行定量分析，用含量除以面積表示蠟質(zhì)的含量。

1.3.2 果皮角質(zhì)膜層提取與分析

用內(nèi)徑為1.7 cm的打孔器在去除蠟質(zhì)成分的每個果實赤道部位均勻取4 個孔，參考Wang Jinqiu[15]和Pacchiano[16]等的方法，將獲得的小圓片進(jìn)行酶解，并略作修改。在酶解過程中，每隔1～2 d換1 次液。為了防止污染，經(jīng)酶解的小圓片立即進(jìn)行連續(xù)提取。用甲醇溶液浸提6 h后用二氯甲烷溶液浸提17 h，最后用四氫呋喃溶液提取20 h。得到的角質(zhì)膜層在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的三氟化硼-甲醇溶液中于70 ℃轉(zhuǎn)酯解聚16 h，冷卻后過濾，加入3 倍體積的飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應(yīng)。最后加入200 μL的正構(gòu)二十四烷（1 μg/μL）為內(nèi)標(biāo)，在氮氣下吹干，貯存于-20 ℃，待測。

角質(zhì)膜層成分分析的步驟為：每個樣品加入一定體積的吡啶，并加入等體積的BSTFA，90 ℃衍生40 min。參考1.3.1節(jié)蠟質(zhì)層成分測定方法，并略做修改。升溫過程為50 ℃保持2 min，以10 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升溫至310 ℃，保持20 min。各角質(zhì)膜層成分經(jīng)GC-MS檢測后得其離子峰，依據(jù)質(zhì)譜庫和文獻(xiàn)進(jìn)行檢索判定，并與內(nèi)標(biāo)比較進(jìn)行相對定量分析，用含量除以面積表示角質(zhì)膜層的含量。

1.3.3 果實表面積測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]，溫州蜜柑和冰糖橙的表面積按下式計算。

式中：X為每個重復(fù)組中果皮的總質(zhì)量/g；D為在每個重復(fù)組中用內(nèi)徑為1.7 cm的打孔器獲得的40 個小圓片的面積/cm2；Y為在每個重復(fù)組中用內(nèi)徑為1.7 cm的打孔器獲得的40 個小圓片的總質(zhì)量/g。

1.3.4 SEM觀察

分別取6 個果面光潔、無機械損傷、大小一致的果實用自來水洗干凈，然后在蒸餾水中清洗3次，自然晾干。參考Liu Dechun等[18]報道的方法制備樣品，用EDT-2000型離子濺射儀（2×10-4MPa，25 mA，300 s）進(jìn)行鍍金膜，最后用EVO/LS10 SEM觀察拍片。

1.3.5 水分損失率測定

分別取30 個果面光潔、無機械損傷、大小一致的溫州蜜柑和冰糖橙，分為A、B、C、D 4 組。A、C組為溫州蜜柑、冰糖橙非處理組（空白），B、D組為溫州蜜柑、冰糖橙處理組。其中，處理組中的果實用阿拉伯膠除去外蠟。將果實在4 ℃貯藏1 周，每隔24 h測量單果質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析和作圖。數(shù)據(jù)結(jié)果以 ±s表示；采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗。P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫州蜜柑和冰糖橙果實表面蠟質(zhì)成分分析

圖1 溫州蜜柑和冰糖橙果實蠟質(zhì)及其各組分含量Fig. 1 Cuticular wax composition of Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange

由圖1可知，溫州蜜柑和冰糖橙外蠟的含量分別為3.7、2.2 μg/cm2，內(nèi)蠟的含量分別為13.9、18.4 μg/cm2，發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑內(nèi)蠟含量是其外蠟含量的4 倍左右，冰糖橙內(nèi)蠟含量是其外蠟含量的8 倍左右。Parsons等[17]也曾對50多個辣椒品種進(jìn)行了角質(zhì)層脂質(zhì)成分分析，發(fā)現(xiàn)不同辣椒品種間總蠟含量最大相差14 倍左右。Wang Jinqiu等[19]發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的外蠟含量分別為1.7、7.2 μg/cm2，總蠟的含量分別為3.8、8.2 μg/cm2。本研究結(jié)果與Wang Jinqiu等[19]的研究結(jié)果不一致，可能是品種和生長環(huán)境的差異造成的。溫州蜜柑和冰糖橙的外、內(nèi)蠟特長鏈脂肪酸化合物主要由烷烴、游離脂肪酸、伯醇等組成。烷烴、脂肪酸、伯醇在溫州蜜柑外蠟中所占的比例分別為50.5%、12.2%、3.2%，在內(nèi)蠟中所占的比例分別為21.7%、6.3%、5.6%。冰糖橙外蠟中烷烴、脂肪酸、伯醇所占的比例分別為45.5%、9.1%、8.6%，內(nèi)蠟中所占的比例分別為13.1%、4.0%、7.6%。本研究中溫州蜜柑和冰糖橙的外蠟和內(nèi)蠟中含量最多的脂肪族化合物均為烷烴。成熟西紅柿[20]、蘋果[21]、蘋果梨[22]等水果中蠟質(zhì)的主要成分是烷烴也曾被報道。然而，Wang Jinqiu等[19]報道紐荷爾臍橙和溫州蜜柑的外蠟含量最多的成分是醛類。本研究結(jié)果與其不一致表明柑橘果實蠟質(zhì)的差異不僅與品種有關(guān)，還與果實生長階段和生長環(huán)境有關(guān)[3-4,8]。此外，通過比較兩種類型柑橘果實表面外蠟和內(nèi)蠟特長鏈脂肪酸化合物的特征，發(fā)現(xiàn)烷烴和游離脂肪酸在外蠟中所占的比例高于內(nèi)蠟，這是溫州蜜柑和冰糖橙外、內(nèi)蠟脂肪族化合物最主要的差異。Liu Dechun等[14]對野生型和突變型紐荷爾臍橙生長過程中的蠟質(zhì)變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蠟相對于外蠟而言，具有較低濃度的脂肪族成分和較高濃度的環(huán)狀化合物，這種差異在果實的成熟階段更明顯，本研究與其結(jié)果一致。

圖2 溫州蜜柑和冰糖橙果實外蠟脂肪族物質(zhì)各成分含量Fig. 2 Aliphatic composition in epicuticular wax of Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange

由圖2可知，溫州蜜柑外蠟中脂肪族物質(zhì)共有11 種，分別為棕櫚酸、硬脂酸、正構(gòu)二十烷、正構(gòu)二十二烷、正構(gòu)二十五烷、正構(gòu)二十六烷、正構(gòu)二十七烷、正構(gòu)二十九烷、正構(gòu)三十烷、正構(gòu)三十一烷、13-二十二烯醇。其中，含量最高的正構(gòu)二十七烷為0.5 μg/cm2，含量最低的正構(gòu)二十二烷低于0.1 μg/cm2。冰糖橙外蠟中脂肪族物質(zhì)共有6 種，分別為棕櫚酸、正構(gòu)二十七烷、正構(gòu)二十八烷、正構(gòu)二十九烷、正構(gòu)三十一烷、13-二十二烯醇。其中，含量最高的正構(gòu)二十八烷為0.5 μg/cm2。在溫州蜜柑外蠟中含量最高的正構(gòu)二十七烷在冰糖橙外蠟中卻最低，低于0.1 μg/cm2。硬脂酸、正構(gòu)二十烷、正構(gòu)二十二烷、正構(gòu)二十五烷、正構(gòu)二十六烷、正構(gòu)三十烷僅在溫州蜜柑外蠟中檢測到，正構(gòu)二十八烷僅在冰糖橙中檢測到。

圖3 溫州蜜柑和冰糖橙果實內(nèi)蠟脂肪族物質(zhì)各成分含量Fig. 3 Aliphatic composition in intracuticular wax of Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange

如圖3所示，溫州蜜柑內(nèi)蠟中脂肪族物質(zhì)共檢出11 種：其中脂肪酸類物質(zhì)分別為棕櫚酸、硬脂酸；烷烴類物質(zhì)分別為正構(gòu)二十烷、正構(gòu)二十二烷、正構(gòu)二十三烷、正構(gòu)二十六烷、正構(gòu)二十七烷、正構(gòu)二十九烷、正構(gòu)三十烷、正構(gòu)三十一烷；伯醇類物質(zhì)僅檢出1 種，為13-二十二烯醇。與圖2比較發(fā)現(xiàn)正構(gòu)二十三烷只在溫州蜜柑內(nèi)蠟中檢測出，正構(gòu)二十五烷只在溫州蜜柑外蠟中檢測出，其他成分在溫州蜜柑內(nèi)外蠟中均檢測出。與溫州蜜柑外蠟相同，溫州蜜柑內(nèi)蠟中含量最高的脂肪族物質(zhì)正構(gòu)二十七烷為1.1 μg/cm2；含量最低的正構(gòu)二十二烷低于0.1 μg/cm2。冰糖橙內(nèi)蠟中共檢測出16 種脂肪族物質(zhì)，比冰糖橙外蠟中脂肪族物質(zhì)多了10 種：其中脂肪酸類物質(zhì)分別為棕櫚酸、硬脂酸、二十二碳酸；烷烴類物質(zhì)分別為正構(gòu)十八烷、正構(gòu)十九烷、正構(gòu)二十烷、正構(gòu)二十三烷、正構(gòu)二十六烷、正構(gòu)二十七烷、正構(gòu)三十烷、正構(gòu)三十一烷、正構(gòu)三十二烷；伯醇類物質(zhì)分別為二十一烷醇、13-二十二烯醇。除冰糖橙內(nèi)蠟中脂肪族物質(zhì)的種類遠(yuǎn)多于冰糖橙外蠟外，含量最高和最低的成分也不同。在冰糖橙內(nèi)蠟中13-二十二烯醇的含量最高，為0.8 μg/cm2；正構(gòu)十九烷含量最低，遠(yuǎn)低于0.1 μg/cm2。此外，溫州蜜柑和冰糖橙的內(nèi)蠟組成成分和含量也存在較大差異。正構(gòu)二十二烷、正構(gòu)二十九烷只在溫州蜜柑內(nèi)蠟中檢測出，二十二碳酸、正構(gòu)十八烷、正構(gòu)十九烷、正構(gòu)二十八烷、正構(gòu)三十二烷、二十一烷醇只在冰糖橙內(nèi)蠟中檢測出。

表1 溫州蜜柑和冰糖橙果實內(nèi)蠟中萜類化合物含量Table 1 Terpenoid composition in intracuticular wax of Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange%

除了脂肪族化合物，在溫州蜜柑和冰糖橙的內(nèi)蠟中還檢測到了大量的萜類物質(zhì)（表1）。溫州蜜柑內(nèi)蠟中萜類物質(zhì)所占的比例為42.1%，其中三萜類化合物檢測到了2 種，為β-香樹精和軟木三萜酮，分別占了萜類物質(zhì)的22.9%和60.4%。除了三萜類化合物，在溫州蜜柑中還檢測到了甾醇類物質(zhì)菜油甾醇和豆甾醇，分別占了萜類物質(zhì)的6.3%和1.9%。冰糖橙內(nèi)蠟中萜類物質(zhì)所占的比例為46.3%，其中三萜類化合物檢測到了4 種，為β-香樹精、α-香樹精、軟木三萜酮和羽扇烯酮，分別占了萜類物質(zhì)的15.7%、9.2%、12.7%和36.7%。僅在冰糖橙內(nèi)蠟中檢測到了菜油甾醇，占萜類物質(zhì)的4.5%。角鯊烯和法尼醇（甾醇和三萜化合物的底物）在冰糖橙內(nèi)蠟中都檢測到，分別占萜類物質(zhì)的13.1%和8.3%，而在溫州蜜柑內(nèi)蠟中僅檢測到角鯊烯，占萜類物質(zhì)的8.5%。Wang Jinqiu等[19]發(fā)現(xiàn)法尼醇和角鯊烯僅存在于紐荷爾臍橙中，在溫州蜜柑中沒有檢測到。Liu Pu等[23]報道，法尼醇的積累能夠抑制柑橘病原菌的生長、保護果實抵抗生物脅迫，實驗中僅在冰糖橙中檢測到金合歡醇，這很好地解釋了冰糖橙比溫州蜜柑有更長貯藏期的原因。

根據(jù)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪族類物質(zhì)主要存在于外蠟中，三萜和甾醇類化合物僅存在于內(nèi)蠟中。先前對不同成分內(nèi)外蠟質(zhì)分配的研究形成了多種假說。Buschhaus等[24]認(rèn)為脂肪族物質(zhì)呈線性一維結(jié)構(gòu)，三萜類物質(zhì)是環(huán)狀，呈二維結(jié)構(gòu)，凝聚狀態(tài)下二者不能相容，因此，三萜類物質(zhì)填充于聚酯結(jié)構(gòu)的角質(zhì)中。這個假說與本實驗的研究結(jié)果一致，很好地解釋了三萜類物質(zhì)僅存在于內(nèi)蠟中的現(xiàn)象。另外還發(fā)現(xiàn)，冰糖橙的外蠟和內(nèi)蠟中都含有角鯊烯，而僅在溫州蜜柑內(nèi)蠟中檢測出角鯊烯，這可能是由于兩種類型柑橘果皮結(jié)構(gòu)存在差異，同時由于角鯊烯分子結(jié)構(gòu)呈線性，與脂肪族物質(zhì)相似，因此，與脂肪族物質(zhì)一樣，在內(nèi)外蠟中均有分布?；谝陨戏治?，之前也有一些研究將蠟質(zhì)應(yīng)用于柑橘的分類中[23]?？傊?，這些結(jié)果為提高不同柑橘類型的耐貯性提供了重要信息。

2.2 溫州蜜柑和冰糖橙果實角質(zhì)膜層成分分析

表2 溫州蜜柑和冰糖橙果實角質(zhì)膜層各組分含量Table 2 Chemical composition of cutin in Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange μg/cm2

如表2所示，溫州蜜柑和冰糖橙的角質(zhì)膜層含量分別為44.00、70.00 μg/cm2，二者含量差異顯著（P＜0.05），由此推測溫州蜜柑的采后貯藏期比冰糖橙短是角質(zhì)膜層的含量低于冰糖橙果實導(dǎo)致的，這與他人的研究結(jié)果具有一致性。Isaacson等[25]發(fā)現(xiàn)在西紅柿中角質(zhì)膜層含量與角質(zhì)層水分滲透之間無相關(guān)性，但是角質(zhì)膜層在保護組織免受微生物侵染中發(fā)揮了重要作用。溫州蜜柑的角質(zhì)膜層主要由9 種成分組成：壬酸、壬二酸、肉桂酸、十六碳酸、十八碳酸、十六碳二酸、二十四烷酸、二十六碳酸、二十八碳酸，含量分別為0.29、2.30、16.90、5.70、1.50、12.00、2.20、1.00、2.20 μg/cm2。冰糖橙角質(zhì)膜層主要由10 種成分組成，分別為月桂酸、壬二酸、肉桂酸、十六碳酸、十六碳二酸、亞油酸、十八碳酸、十八碳二酸、二十碳酸、二十四烷酸，含量分別為0.30、1.90、32.60、7.40、8.60、0.40、2.30、14.90、0.50、1.10 μg/cm2。肉桂酸是溫州蜜柑和冰糖橙角質(zhì)膜層含量最多的成分。溫州蜜柑角質(zhì)膜層含量最低的成分為壬酸，冰糖橙角質(zhì)膜層含量最低的為月桂酸。本研究中溫州蜜柑和冰糖橙的角質(zhì)膜層在含量和組分上差異顯著（P＜0.05），這與他人的研究結(jié)果一致。Parsons等[17]也曾對50多個辣椒品種進(jìn)行了角質(zhì)層脂質(zhì)成分分析，發(fā)現(xiàn)不同辣椒品種間角質(zhì)膜層單體含量最大相差16 倍左右，其中十六碳酸、十八碳酸、肉桂酸變化范圍為54%～87%、10%～38%、0.2%～8.0%。此外，將溫州蜜柑和冰糖橙的蠟質(zhì)和角質(zhì)膜層進(jìn)行組分及含量比較，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)主要由特長鏈飽和脂肪酸及其衍生物、萜類物質(zhì)組成，角質(zhì)膜層是由羥基脂肪酸組成，表明蠟質(zhì)和角質(zhì)膜層有不同的合成路徑。Parsons等[17]對50多個辣椒品種進(jìn)行角質(zhì)層脂質(zhì)成分分析也得到了同樣的結(jié)果。

2.3 溫州蜜柑和冰糖橙果實表面蠟質(zhì)晶體形態(tài)分析

圖4 溫州蜜柑（A）和冰糖橙（B）果實表面蠟質(zhì)SEM圖（×1 500）Fig. 4 SEM of epicuticular waxes in Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange (× 1 500)

如圖4所示，兩種類型柑橘果實表面都由無定型蠟質(zhì)和散落在其上的蠟質(zhì)晶體組成：溫州蜜柑的外蠟晶體呈較小、不規(guī)則血小板狀，這些血小板狀晶體雖然聚集在一起但是沒有覆蓋整個果實表面，溫州蜜柑表皮細(xì)胞的某些區(qū)域明顯沒有蠟質(zhì)晶體；冰糖橙的外蠟晶體呈較大、不規(guī)則、扁平的血小板狀，這在成熟柑橘中是很普遍的。王金秋等[26]報道，寬皮柑橘與緊皮柑橘相比蠟質(zhì)含量較低，蠟質(zhì)晶體較小。溫州蜜柑與冰糖橙的蠟質(zhì)晶體形態(tài)存在明顯差異，這可能是由于品種以及蠟質(zhì)各成分含量的差異引起的。Koch等[27]曾報道伯醇有利于形成垂直板狀形態(tài)的晶體。Wang Jinqiu等[19]曾報道，醛和烷烴在紐荷爾臍橙中占的比例越高，形成的扁平血小板狀晶體就越大。在本研究中，伯醇在溫州蜜柑和冰糖橙的外蠟中所占的比例很低，分別為3.3%和8.5%。相反，烷烴在溫州蜜柑和冰糖橙的外蠟中所占的比例最高，分別為51.1%和45.3%。這一結(jié)果與蠟質(zhì)晶體的形態(tài)一致，表明烷烴在組裝扁平、更大的血小板狀蠟質(zhì)晶體時比伯醇發(fā)揮了更大的作用。本實驗結(jié)果與其他的研究者得到的結(jié)果具有一致性[18]。然而，在本研究中，溫州蜜柑的烷烴含量多于冰糖橙，但形成的晶體結(jié)構(gòu)卻比冰糖橙小，與他人的研究不一致，可能是由于它們蠟質(zhì)各成分的差異引起的。由于蠟質(zhì)成分與蠟質(zhì)晶體形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)系復(fù)雜，因此對于柑橘蠟質(zhì)成分對蠟質(zhì)晶體形態(tài)的影響，還需要進(jìn)一步研究。

2.4 溫州蜜柑和冰糖橙蠟質(zhì)保水能力分析

圖5 溫州蜜柑和冰糖橙果實貯藏1 周水分損失率Fig. 5 Water loss rates of Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange during storage for one week

通過覆蓋表皮和保衛(wèi)細(xì)胞，蠟質(zhì)層在調(diào)節(jié)水果的保水能力方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。在提取內(nèi)蠟的過程中，氯仿會滲入水果內(nèi)部從而影響其代謝。因此，本實驗中僅研究了外蠟對水果保水能力的影響，如圖5所示，在前4 d的貯藏過程中，對照組和處理組中的溫州蜜柑平均水分損失率分別為0.6%和0.9%，對照組和處理組中的冰糖橙平均水分損失率分別為0.3%和0.5%，外蠟的除去會顯著增加溫州蜜柑和冰糖橙的水分損失速率（P＜0.05），與他人的研究結(jié)果一致。Wang Jinqiu等[15]報道內(nèi)蠟和角質(zhì)膜層在果實生長的早期階段發(fā)揮著重要的保水作用，然而，當(dāng)角質(zhì)層厚度達(dá)到一定程度時，保水能力取決于蠟質(zhì)含量。Vogg等[28]報道，西紅柿表面外蠟的去除會導(dǎo)致水分損失的增加。在貯藏4 d之后，處理組中的冰糖橙水分損失速率下降，這可能是因為新的外蠟在這些水果上形成，外蠟在保水方面可能發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。此外，在對照組中，溫州蜜柑的日水分損失率是冰糖橙的2 倍左右。從2 個柑橘品種的果皮結(jié)構(gòu)分析，溫州蜜柑屬于寬皮柑橘而冰糖橙屬于緊皮柑橘，二者果皮結(jié)構(gòu)的厚度不同，尤其是溫州蜜柑的白皮層厚度遠(yuǎn)低于冰糖橙，這可能是造成溫州蜜柑水分損失更快的原因之一。同時，溫州蜜柑總蠟含量比冰糖橙低可能是引起二者水分損失率差異的另一個原因。王金秋等[26]曾報道蠟質(zhì)成分及結(jié)構(gòu)與果皮結(jié)構(gòu)存在一定聯(lián)系，對多種寬皮柑橘和緊皮柑橘的蠟質(zhì)分析表明，寬皮柑橘和緊皮柑橘在一維上不同，暗示果皮蠟質(zhì)與果皮結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上可能存在一定的連鎖關(guān)系。本研究推測對照組中溫州蜜柑和冰糖橙的水分損失率差異既受果皮結(jié)構(gòu)影響，也受蠟質(zhì)含量的影響。但果皮結(jié)構(gòu)是單獨直接影響柑橘水分損失，還是通過影響蠟質(zhì)的成分及結(jié)構(gòu)與其相互作用來間接影響柑橘的水分損失還需要進(jìn)一步的探究。

表3 溫州蜜柑和冰糖橙總蠟質(zhì)及各組分含量與水分損失率間相關(guān)性分析（n＝4）Table 3 Correlational analysis between cuticular wax components and water loss rate in Satsuma mandarin and Bingtang sweet orange (n= 4)

為了說明蠟質(zhì)中單個組分對水果保水的貢獻(xiàn)，對兩個柑橘品種總蠟中各個組分與水分損失率間相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)水分損失與各組分間所占的比例有關(guān)。如表3所示，總蠟（r＝-0.995）、伯醇（r＝-0.866）、烷烴（r＝-0.090）含量與水分損失呈負(fù)相關(guān)。脂肪酸（r＝0.020）、萜類（r＝0.395）含量與水分損失率呈正相關(guān)。此外，溫州蜜柑總蠟中脂肪酸和烷烴含量分別為8.9%和33%，冰糖橙總蠟中脂肪酸和烷烴含量分別為6.5%和29%，冰糖橙中烷烴與脂肪酸含量之比高于溫州蜜柑。將烷烴與脂肪酸含量之比與水分損失率間進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)烷烴與脂肪酸含量之比與水分損失率呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.697），表明相對于脂肪酸組分，烷烴在保水方面具有更顯著的作用，這與溫州蜜柑和冰糖橙間水分損失率的差異具有一致性。Bourdenx等[29]曾經(jīng)報道隨著擬南芥表皮細(xì)胞中烷烴的積累，擬南芥的耐旱性越來越強。Parsons等[17]對多個辣椒品種的角質(zhì)層脂質(zhì)成分與水分損失進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，水分流失與烷烴比例呈負(fù)相關(guān)，與脂肪酸比例呈正相關(guān)。Kosma等[30]研究證明游離脂肪酸帶有分子電荷，不利于角質(zhì)層間分子的靠近、壓縮，從而增加了水分?jǐn)U散途徑的相對大小和水分?jǐn)U散量。人工合成蠟通常會產(chǎn)生異味，但高濃度的天然蠟可以在不產(chǎn)生異味的情況下阻止水分損失，表明如果人工合成蠟與天然蠟相似，將更加有助于維持水果貯藏時的品質(zhì)?？紤]到人工合成蠟的成分與柑橘天然蠟的成分顯著不同，在新的人工合成蠟中添加具有重要保水作用的烷烴是很有必要的，這個結(jié)果為柑橘人工合成蠟的生產(chǎn)提供了重要信息。

3 結(jié) 論

綜上所述，溫州蜜柑和冰糖橙的內(nèi)蠟含量遠(yuǎn)高于外蠟，分別約為外蠟含量的4 倍和8 倍。兩種類型柑橘果實表面蠟質(zhì)脂肪族物質(zhì)主要成分相同，為烷烴、游離脂肪酸、伯醇，但不同類別物質(zhì)含量有差別。萜類物質(zhì)的三萜類和甾醇僅在內(nèi)蠟中檢測出。冰糖橙的內(nèi)、外蠟中都含有角鯊烯，而僅在溫州蜜柑內(nèi)蠟中檢測出角鯊烯，這可能是由于2 種類型柑橘果皮結(jié)構(gòu)的差異所致。此外，兩種類型角質(zhì)膜層含量和組分差異顯著（P＜0.05），但主要成分相同。外蠟的除去會顯著增加溫州蜜柑和冰糖橙的水分損失速率（P＜0.05），而相對于脂肪酸組分，烷烴在保水方面具有更顯著的作用（P＜0.05），這和烷烴與脂肪酸之比在冰糖橙中較高的研究結(jié)果一致。因此，在新的人工合成蠟中添加具有重要保水作用的烷烴是很有必要的。2 種類型柑橘果實表面蠟質(zhì)化學(xué)組分和晶體形態(tài)存在顯著差異（P＜0.05），與兩種類型柑橘水分損失率差異具有一致性。這些結(jié)果為不同柑橘耐貯性的提高提供了重要信息。

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