葉幕微氣候差異對‘摩爾多瓦’葡萄花色苷的影響

劉笑宏，郭淑華，肖秋紅，杜遠(yuǎn)鵬，翟 衡,*

進(jìn)入21世紀(jì)，氣候變暖趨勢越來越明顯，亞洲中高緯地帶變暖最為顯著[1]，高溫強(qiáng)光等極端天氣在我國葡萄產(chǎn)區(qū)生長季節(jié)頻繁出現(xiàn)，對葡萄生產(chǎn)造成了逆境傷害[2]。生產(chǎn)上人們比較重視高溫強(qiáng)光對葡萄葉片和果實(shí)生長的影響，如日灼和氣灼現(xiàn)象[3-4]，但較少關(guān)注其對葡萄次生代謝品質(zhì)的影響?；ㄉ兆鳛槠咸汛紊x的重要產(chǎn)物，是葡萄的主要呈色物質(zhì)，影響著葡萄漿果及葡萄酒的色澤、風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值等[5]；同時(shí)，由于其結(jié)構(gòu)類似單寧、類黃酮、黃烷醇，屬于具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的含羥基衍生物酚類物質(zhì)，可以有效清除活性氧粒子[6-7]。抗氧化性是花色苷一項(xiàng)重要的生理功能[8-9]，但高溫能顯著加重其降解[10-11]，從而降低葡萄與葡萄酒的品質(zhì)。因此，尋找一種科學(xué)有效的方式來應(yīng)對氣候變暖對葡萄造成的傷害已迫在眉睫。通過改變葡萄栽培架式或葉幕類型來調(diào)控微氣候，從而改善果實(shí)品質(zhì)是一個(gè)簡便易行的技術(shù)措施。研究表明，果實(shí)轉(zhuǎn)色期氣溫差及生育全期平均相對濕度對果實(shí)綜合品質(zhì)具有重要影響[12]，而合理的葉幕類型可有效降低果實(shí)表面溫度，使花色苷等重要次生代謝物質(zhì)含量達(dá)到最優(yōu)水平[13]。因此，選擇適宜的葉幕類型是保證葡萄品質(zhì)的基礎(chǔ)，對我國葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極作用。釀酒葡萄主要采用籬架栽培，其形成的直立葉幕光照充足，作業(yè)方便，但葉幕周邊的微氣候波動較大，相比之下，棚架水平葉幕下果實(shí)周邊微氣候相對穩(wěn)定，而外部又光照充足，可提高果實(shí)品質(zhì)[14]。

本實(shí)驗(yàn)以釀酒與鮮食兼用葡萄品種‘摩爾多瓦’為試材，通過比較不同葉幕類型形成的微氣候?qū)ζ咸鸦ㄉ盏挠绊?，尋求有利于提高葡萄漿果花色苷品質(zhì)的栽培架式，同時(shí)結(jié)合外部環(huán)境與內(nèi)部機(jī)制來探討兩種葉幕類型對果實(shí)花色苷的影響，為應(yīng)對氣候變化而改變栽培架式提供充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)環(huán)境

以2010年定植的鮮食與釀酒兼用品種‘摩爾多瓦’（Moldova：Guzal Kala×Villard blanc）為試材。實(shí)驗(yàn)于2015—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)核心葡萄示范園進(jìn)行，其所在地位于東經(jīng)117°08’，北緯36°11’，屬于暖溫帶半濕潤性季風(fēng)氣候，其年平均氣溫12.9 ℃，10 ℃以上的活動積溫為4 213 ℃，年平均降水量約為700 mm，年平均日照時(shí)間約為2 627 h。

1.2 儀器與設(shè)備

L92-1溫濕度監(jiān)測器 中國路格科技有限公司；PB-10 pH計(jì) 德國Sartorius公司；CR-10便攜式測色儀中國柯盛行儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ離心機(jī) 中國安科公司；SHB-III真空泵 中國長城科工貿(mào)有限公司；YRE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中國予華儀器有限責(zé)任公司；ZMD 4000高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 植株栽培與實(shí)驗(yàn)前處理

以小棚架龍干形代表水平葉幕、籬架單干單臂形代表直立葉幕，棚架和籬架均為南北行向，行距2.2 m，高2 m，棚架株距1.7 m，籬架株距1.2 m，兩種架式均從新梢發(fā)育開始控制留梢量，每平方米5 個(gè)結(jié)果枝、50～55 個(gè)葉片，每個(gè)結(jié)果枝留2 個(gè)果穗，在黃豆大小時(shí)疏去副穗和穗尖。棚架和籬架每個(gè)架式各36 株，均種植2 行。生長期內(nèi)修剪及肥水管理等技術(shù)統(tǒng)一。2015年6月1日及2016年6月4日（果實(shí)膨大期）分別在棚架、籬架距離果穗處5 cm左右安裝溫濕度監(jiān)測器各兩套，每30 min記錄一次果實(shí)周圍溫濕度，每日記錄48 個(gè)數(shù)值，直至果實(shí)成熟。

2015年將每種葉幕類型分為4 個(gè)小區(qū)（9 株/小區(qū)），自轉(zhuǎn)色期（7月27日、花后9～11 周）至成熟期（9月17日、花后15 周）每2 周采樣一次，共4 次。采樣時(shí)，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)采集4 個(gè)果穗，其中籬架直立葉幕為東西兩側(cè)交叉采樣，取靠近中間部位新梢上的果穗，立即帶回實(shí)驗(yàn)室取下果粒，同一小區(qū)分別混勻，各小區(qū)每5 粒漿果剝皮后，果皮單獨(dú)成包，每個(gè)時(shí)期每個(gè)處理至少15 包，液氮冷凍后存于-80 ℃，供花色苷代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量、酶活力及花色苷單體測定，另保留部分剪取的果實(shí)鮮樣測定果實(shí)品質(zhì)，其余果實(shí)（測定時(shí)去除種子，僅使用果皮及果肉）用液氮冷凍后，置于-40 ℃冰箱保存，供其他果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3.2 測定指標(biāo)

1.3.2.1 基本生理指標(biāo)及次生代謝產(chǎn)物含量的測定

果實(shí)百粒質(zhì)量、pH值、可滴定酸、色度的測定取混勻的新鮮果實(shí)，其余指標(biāo)的測定均取凍存的樣品。

取100 粒漿果使用天平稱取質(zhì)量，即為漿果百粒質(zhì)量，重復(fù)5 次；取5 粒漿果，擠汁離心后用pH計(jì)測定果汁的pH值；酸堿滴定法測定可滴定酸質(zhì)量濃度[21]，重復(fù)3 次。

取單粒漿果使用便攜式測色儀測定果實(shí)色度，重復(fù)30 次。L、a、b分別表示果實(shí)亮度、紅綠度、黃藍(lán)度，以籬架果實(shí)為對照，按式（1）計(jì)算棚架與籬架的色差值（ΔE）。

式中：L、a、b值表示測定的棚架果實(shí)值，L0、a0、b0值表示測定的籬架果實(shí)值。ΔE范圍為0.0～0.5，表示色差微小；0.5～1.0表示色差微小到中等；1.0～2.0表示色差中等；2.0～4.0表示色差較大。

3,5-二硝基水楊酸法測定果實(shí)還原糖質(zhì)量濃度[22]；Folir-Denis法測定果實(shí)單寧含量[23]；Folin-Cioealetu法測定果實(shí)總酚含量[24]；亞硝酸鹽-氯化鋁法測定果實(shí)類黃酮含量[25]；香草醛-鹽酸法測定果實(shí)黃烷醇含量[26]；pH示差法測定果實(shí)花色苷含量[27]；鐵還原法測定果實(shí)抗壞血酸的含量[22]。所有指標(biāo)均按田間重復(fù)進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定3 次。

1.3.2.2 葡萄果皮花色苷單體含量的測定

花色苷單體的測定采用HPLC-MS技術(shù)，色譜條件如下：色譜柱為BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，7 μm）流動相A為乙腈，流動相B為2%甲酸水溶液，流速為0.3 mL/min，柱溫45 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，檢測波長為520 nm。洗脫程序?yàn)?～20 min，6%～16% A；20～28 min，16%～23% A；28～35 min，23%～50% A；35～37 min，50% A；37～40 min，50%～6% A。

MS儀鑒定花色苷，設(shè)置雙通道，正離子模式，MS范圍為50～2 000 m/z，1通道和2通道的碰撞能量分別為6.0 eV和25.0 eV，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為30.0 V，錐孔氣流速和脫溶劑氣流速分別為10 L/h和700 L/h，離子源溫度和脫溶劑氣溫度分別為100 ℃和400℃。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為二甲花翠素3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside，Mv），做Mv的外標(biāo)定量，質(zhì)量濃度梯度為0～500 mg/L，7 個(gè)水平，其他花色苷以Mv含量計(jì)。本研究花色苷定性工作基于葡萄與葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS/MS指紋譜庫[15-16]，利用MS全離子掃描圖譜，通過對樣品質(zhì)譜分析、保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[17]報(bào)道比對分析，確定單體花色苷的種類。MS結(jié)果用Mass Lynx V4.1分析軟件進(jìn)行分析，物質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及Lopes-da-Silva等[18]的方法。

1.3.2.3 葡萄果皮基因相對表達(dá)量的測定

漿果果皮花色苷RNA的提取、定量參照文獻(xiàn)[19]的方法并略有改動，測定花色苷代謝途徑中的合成基因VvUFGT與VvLDOX、修飾基因Vv5GT與VvOMT及降解基因VvPPO 5 個(gè)基因的相對表達(dá)量。具體步驟如下：1）取0.1 g左右液氮研磨的葡萄果皮，加入1 mL提取試劑（4 ℃），振蕩至徹底混勻，室溫下平放5 min，4 ℃、1 200 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管中，加入200 μL的5 mol/L NaCl。2）加入600 μL氯仿，上下顛倒間歇性振蕩混勻5 min，之后于4 ℃、1 200 r/min離心10 min，取上層水相轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管中（重復(fù)此步驟一次）。3）加入與所得水相等體積提前冷凍的異丙醇，混勻，于-20 ℃環(huán)境中放置30 min后，4 ℃、1 200 r/min離心20 min，棄掉上清液，加入1 mL 75%的乙醇溶液，再次離心后倒出液體，室溫下晾干2～3 min。4）加入10 μL無RNase水，反復(fù)吹打混勻，充分溶解RNA，-80 ℃保存。

1.3.2.4 葡萄果皮相關(guān)酶活力的測定

相關(guān)酶活力的測定采用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法，具體參照曹鵬[20]的實(shí)驗(yàn)方法，略有修改。酶的活力單位以U表示，即在特定條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物（或者底物中1 μmol有關(guān)基團(tuán)）所需的酶量。具體步驟如下：

取1 g組織加入9 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），混勻，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液待檢。將標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書稀釋5 個(gè)梯度，各個(gè)梯度每孔加樣量都為50 μL。

加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5 次，拍干。

加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5 次，拍干。

顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。

以空白孔調(diào)零，于450 nm波長處依序測量各孔的吸光度。測定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及作圖，采用DPS 7.05單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析法進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉幕類型對葡萄果際微氣候及基本生理指標(biāo)的影響

2.1.1 不同架式/葉幕類型微域環(huán)境溫度差異

圖1 架式/葉幕類型對果際溫度的影響Fig. 1 Effects of trellis systems/ canopy types on temperature around grape fruits

2015、2016兩年的溫度監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)均顯示，棚架水平葉幕下的實(shí)時(shí)溫度波動及日平均氣溫均小于籬架直立葉幕（圖1），即棚架的水平葉幕具有較明顯的小氣候調(diào)節(jié)作用，這種效果在高溫天氣尤為顯著。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在高溫月7～8月，2015年籬架直立葉幕下35 ℃以上實(shí)時(shí)高溫所占總測定數(shù)據(jù)的14.05%，是棚架水平葉幕的5.22 倍，2016年果實(shí)發(fā)育期間，高溫比例相對較低，但籬架直立葉幕35 ℃以上實(shí)時(shí)高溫所占總數(shù)據(jù)的比例也達(dá)到了8.77%，是棚架水平葉幕的3.18 倍。

2.1.2 不同架式/葉幕類型微域環(huán)境濕度差異

圖2 架式/葉幕類型對果際濕度的影響Fig. 2 Effects of trellis systems/canopy types on humidity around grape fruits

與籬架相比，棚架直立葉幕日平均濕度相對較高、波動范圍較小（圖2）。實(shí)時(shí)監(jiān)控果實(shí)發(fā)育期6～9月的溫濕度變化結(jié)果表明，2015年監(jiān)控期內(nèi)棚架下微環(huán)境實(shí)時(shí)濕度在60%～80%范圍的比例為20.75%，比籬架高28.95%；而易引發(fā)病害的高濕天氣（相對濕度≥90%）的比例為38.43%，反比籬架的低4.53%；2016年與2015年相比，測定期內(nèi)降水較多，棚架下相對濕度60%～80%的比例比籬架高3.10%；相對濕度不低于90%的比例比籬架低3.77%。

2.2 葉幕類型對葡萄果實(shí)基本生理指標(biāo)的影響

表1 葉幕類型對葡萄果實(shí)基本生理指標(biāo)的影響Table 1 Effects of canopy types on physicochemical indexes of grapes

棚架水平葉幕果實(shí)百粒質(zhì)量、可滴定酸質(zhì)量濃度、還原糖質(zhì)量濃度整體高于籬架直立葉幕果實(shí)（表1）。2015年，棚架水平葉幕果實(shí)百粒質(zhì)量、可滴定酸和還原糖質(zhì)量濃度分別比籬架直立葉幕果實(shí)顯著增高5.48%、4.35%、2.39%；2016年棚架與籬架果實(shí)百粒質(zhì)量差異縮小至3.30%，可滴定酸含量差異增大到8.07%，還原糖質(zhì)量濃度比籬架果實(shí)略低，但差異并不顯著。連續(xù)兩年，兩種葉幕類型下果實(shí)均達(dá)到中等色差，即葉幕類型改變果實(shí)色澤。

2.3 葉幕類型對葡萄果實(shí)次生代謝產(chǎn)物含量的影響

由表2可知，2015年棚架水平葉幕葡萄果實(shí)花色苷、類黃酮含量分別比籬架直立葉幕果實(shí)高27.11%、44.89%，而總酚、黃烷醇、單寧、抗壞血酸含量無顯著差異；2016年棚架水平葉幕果實(shí)總酚、黃烷醇、花色苷含量分別比籬架直立葉幕果實(shí)高5.09%、13.67%、6.45%，但單寧、抗壞血酸含量均顯著低于籬架直立葉幕果實(shí)（表2）。

表2 葉幕類型對葡萄果實(shí)次生代謝產(chǎn)物含量的影響Table 2 Effects of canopy types on secondary metabolites of grape fruits mg/g

2.4 葉幕類型對葡萄果皮花色苷單體的影響

‘摩爾多瓦’的花色苷以雙葡萄糖苷花色苷為主（表3）?；ê? 周即轉(zhuǎn)色初期，兩種葉幕葡萄果皮的花色苷單體組分并不相同，且花色苷單體以基本結(jié)構(gòu)花色苷為主，僅檢測到二甲花翠素3-O-（c-6-O-香豆酰）葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、花翠素3-O-（6-O-香豆酰）葡萄糖苷等6種香豆?；ㄉ諉误w，且除二甲花翠素3-O-（c-6-O-香豆酰）葡萄糖苷外，均以籬架直立葉幕葡萄果皮的含量較高；花后11 周是花色苷單體含量及種類急劇增加階段，棚架水平葉幕花色苷單體種類完善且完成各種修飾，而籬架直立葉幕花色苷單體含量增長相對緩慢，直至花后15 周才檢測到所有的花色苷單體，修飾節(jié)奏亦相對緩慢。果實(shí)成熟時(shí)（花后15 周），兩種葉幕下的葡萄果皮中均檢測到21 種花色苷單體，但其單體含量差異較大。

果實(shí)成熟時(shí)，棚架水平葉幕葡萄果皮中有19 種花色苷單體含量高于籬架直立葉幕的，其中13 種單體含量差異達(dá)顯著水平，花翠素3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷、甲基花翠素3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷、二甲花翠素3-O-（c-6-O-香豆酰）葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷、甲基花青素3-O-（6-O-香豆酰）葡萄糖苷5 種花色苷單體含量分別比籬架直立葉幕的高32.59%、31.47%、39.80%、33.19%、31.09%，二甲花翠素3-O-（c-6-O-香豆酰）葡萄糖苷含量甚至比籬架直立葉幕的高74.41%，棚架水平葉幕葡萄果皮中僅有甲基花青素3-O-葡萄糖苷含量比籬架果實(shí)顯著降低14.89%。

表3 葉幕類型對葡萄果皮花色苷組分及含量的影響Table 3 Effects of canopy types on anthocyanin composition of grape skin mg/kg

表4 葉幕類型對成熟期葡萄果皮修飾性花色苷含量及比例的影響Table 4 Effects of canopy types on modified anthocyanin contents and percentages in grape skin at maturity

圖3 葉幕類型對葡萄果皮花色苷含量的影響Fig. 3 Effects of canopy types on anthocyanin content in grape skin

由表4可知，葡萄成熟時(shí)，在修飾性花色苷的含量方面，棚架水平葉幕葡萄果皮甲基化、乙酰化、香豆?；揎椥曰ㄉ蘸烤哂诨h架，其中乙?；揎椥曰ㄉ蘸勘然h架顯著提高32.68%；在花色苷的修飾程度方面，棚架葡萄果皮花色苷的乙酰化花色苷比例比籬架顯著提高22.84%，香豆?；c總修飾程度無顯著差異。圖3為葡萄果皮花色苷總含量變化，棚架水平葉幕葡萄果皮花色苷含量在花后9 周（轉(zhuǎn)色初期）含量顯著低于籬架直立葉幕，但之后增長較快，花后11 周時(shí)總含量顯著高于籬架直立葉幕26.70%，11 周之后花色苷增長速率有所下降，至果實(shí)成熟時(shí)，兩者果皮花色苷含量差距縮小，但棚架水平葉幕依然比籬架直立葉幕的葡萄果皮顯著高8.05%。

2.5 葉幕類型對花色苷代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量及酶活力的影響

2.5.1 對花色苷代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖4 葉幕類型對花色苷代謝途徑酶相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 4 Effects of canopy types on relative gene expression of enzymes involved in anthocyanin metabolic pathway

花色苷代謝途徑中，兩種葉幕類型葡萄果皮的VvUFGT、VvLDOX、Vv5GT 3 種基因表達(dá)趨勢較為一致，但VvOMT、VvPPO差異較大（圖4）?；ê? 周，棚架葡萄果皮花色苷修飾基因Vv5GT表達(dá)量相對于籬架直立葉幕較高，合成基因VvUFGT、VvLDOX表達(dá)量則相對較低；花后11～13 周棚架水平葉幕葡萄果皮VvUFGT、VvOMT、VvPPO表達(dá)量上調(diào)，尤以修飾基因VvOMT較為顯著，VvLDOX、Vv5GT表達(dá)量則顯示下調(diào)狀態(tài)。整個(gè)測定過程中，兩種葉幕類型葡萄果皮花色苷僅有VvOMT、VvPPO在花后9～11 周表達(dá)趨勢相反，花后11 周之后，除VvOMT在花后13～15 周表達(dá)略有不同外，兩種葉幕類型的花色苷代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)趨勢較為一致。

2.5.2 對葡萄果皮酶活力的影響

圖5 葉幕類型對花色苷代謝途徑相關(guān)酶活力的影響Fig. 5 Effects of canopy types on enzyme activities involved in anthocyanin metabolic pathway

果實(shí)發(fā)育過程中，兩種葉幕類型下的葡萄果皮花色苷途徑相關(guān)酶活力相差較大，僅多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力變化趨勢較為一致（圖5）。籬架直立葉幕花色苷在果實(shí)發(fā)育前期表現(xiàn)出較為明顯的合成優(yōu)勢，其合成相關(guān)酶UDP-葡萄糖-3-O-類黃酮糖苷轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）、無色花色素氧化酶（leucoanthocyanin dioxygenase，LDOX）活力在花后9～11 周顯著高于棚架水平葉幕的，但修飾酶花青素苷-5-O-葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶（anthocyanin 5-O-glucosyltransferase，5GT）活力相對較低；而棚架水平葉幕葡萄果皮花色苷除合成酶LDOX、氧化酶PPO外，其他合成、修飾相關(guān)酶在果實(shí)發(fā)育過程中活力變化趨勢較為一致，且花后13～15 周活力顯著增高。籬架直立葉幕的花色苷代謝途徑相關(guān)酶UFGT、LDOX、O-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT）、5GT、PPO活力變化同步性較差，且UFGT、LDOX、5GT在果實(shí)發(fā)育中后期（11～15 周）有活力下降趨勢。

綜合比較兩種葉幕類型葡萄果皮花色苷代謝過程中的基因表達(dá)與酶活力趨勢發(fā)現(xiàn)，9～13 周，籬架直立葉幕UFGT、LDOX、OMT、5GT、PPO 5 種酶的基因表達(dá)量與酶活力變化均趨勢一致，而棚架水平葉幕的變化趨勢一致性較差。

3 討 論

3.1 葉幕類型對葡萄微環(huán)境的影響

栽培架式?jīng)Q定葉幕類型，葉幕類型通過調(diào)節(jié)光熱條件形成不同的葉幕微氣候[28]。棚架果實(shí)與地面相距較遠(yuǎn)，水平葉幕又具有遮陰作用，架下受光極低，既解決了幕下果實(shí)直接曝光的問題，又可使架下地面免受強(qiáng)光直射，從而減少架下微域環(huán)境的溫度波動及高溫比例，尤其在高溫月份，水平葉幕的優(yōu)勢更為顯著[14]；而籬架則由于葉幕直立，形成的遮陰面積相對較小，且果實(shí)距地面相對較近，受地面的強(qiáng)光反射及溫度影響較大，容易造成果實(shí)日灼現(xiàn)象[29]。

棚架遮蔽地面導(dǎo)致土壤蒸發(fā)量小于籬架，適宜果實(shí)發(fā)育的濕度比例較高而高濕比例較低，較少引發(fā)葡萄果實(shí)病害[30-31]；可能是由于棚架的果穗遠(yuǎn)離地面、空間懸垂，通風(fēng)條件較好，而籬架的果穗距離地面僅80 cm左右，果穗周邊有葉片貼近，受到地面濕氣的蒸騰易發(fā)生汽灼現(xiàn)象[32]，雨后也容易積滯水分引發(fā)病害。

3.2 葉幕微環(huán)境對果實(shí)品質(zhì)的影響

葉幕微氣候不同，果實(shí)品質(zhì)差異較大[33]。實(shí)驗(yàn)中，棚架果實(shí)百粒質(zhì)量、可滴定酸質(zhì)量濃度和總酚、花色苷、黃烷醇等物質(zhì)含量連續(xù)兩年均高于籬架直立葉幕的。一方面可能是由于棚架枝蔓水平生長，結(jié)果母枝與結(jié)果枝之間存在一定角度，削弱了新梢頂端優(yōu)勢[31]，從而利于將更多的營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)中；另一方面，通過測定葡萄的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光及高溫強(qiáng)光天氣會導(dǎo)致直立葉幕葉片Pn顯著降低，水平葉幕則顯著緩解高溫、強(qiáng)光的脅迫作用，高溫強(qiáng)光天氣下，其Pn仍高于直立葉幕葉片；強(qiáng)光和高溫強(qiáng)光條件下棚架葉片的光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率、捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過光系統(tǒng)Ⅱ初級電子受體的其他電子受體的概率和用于電子傳遞的量子產(chǎn)額均比籬架葉片顯著提高[34]。由此推測，棚架通過改善高溫逆境條件下葉片光系統(tǒng)的能量分配，緩解了高溫高光脅迫，減少了呼吸消耗[35]，從而改善了葡萄品質(zhì)。

3.3 葉幕微環(huán)境對花色苷單體的影響

花色苷的合成是由一系列酶相互作用產(chǎn)生的，結(jié)構(gòu)基因可直接編碼花色苷生物合成的相關(guān)酶類[36-38]，花色苷的含量與其合成及修飾等相關(guān)酶基因表達(dá)量及酶活力成顯著正相關(guān)[39-41]。研究表明，高溫、強(qiáng)光照對果實(shí)造成氧化脅迫，影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量，誘導(dǎo)果實(shí)中的過氧化物酶含量上升，減少果皮中花青素含量[42-43]，35 ℃以上高溫促進(jìn)花色苷降解的同時(shí)抑制花色苷的合成[43]。本實(shí)驗(yàn)中，果實(shí)成熟時(shí)，棚架水平葉幕下果實(shí)以及果皮花色苷總含量較籬架直立葉幕顯著提高，可能是由于在果實(shí)生長發(fā)育過程中，水平葉幕下花色苷各基因表達(dá)的同步性及各酶活力變化的同步性使得花色苷在合成之后修飾更為及時(shí)；而花色苷的甲基化程度、酰化程度增高使花色苷穩(wěn)定性更強(qiáng)、顏色更深[44-48]，不易受到水分子的攻擊，增強(qiáng)其穩(wěn)定性[18]，這與前人研究結(jié)果一致[41,49]。盡管水平葉幕的分解酶PPO活力也相對較高，但其對花色苷含量影響較小，可能是由于PPO對花色苷具有雙重作用，一方面，其可將查爾酮作為特異性底物，催化形成花色苷呈色物質(zhì)類黃酮噢哢；另一方面，其又決定了花色苷的降解[50-51]。此外，Kliewer等[52]研究表明，10 ℃以上的晝夜溫差會抑制果實(shí)的正常著色，本實(shí)驗(yàn)中，直立葉幕下微環(huán)境的溫度波動顯著高于水平葉幕，這可能也是導(dǎo)致直立葉幕葡萄果實(shí)花色苷含量低于水平葉幕的原因之一。

由此可見，棚架水平葉幕可有效緩解生態(tài)逆境對葡萄品質(zhì)（尤其是花色苷含量）造成的脅迫傷害。因此，棚架水平葉幕緩解逆境脅迫的作用值得在高溫及強(qiáng)光脅迫地區(qū)不同品種上進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

棚架水平葉幕顯著改善了‘摩爾多瓦’果實(shí)微域環(huán)境，提高了葡萄果實(shí)百粒質(zhì)量、還原糖質(zhì)量濃度和總酚、類黃酮、黃烷醇含量，增加了成熟期果皮花色苷含量，打破了果實(shí)著色過程中，花色苷代謝途徑相關(guān)酶活力與基因表達(dá)變化趨勢的一致性，但未改變花色苷單體種類。

參考文獻(xiàn)：

[1] STOCKER T F, QIN D, PLATTNER G K, et al. Climate change 2013: the physical science basis[M]. New York: Cambridge University Press, 2013: 1-9.

[2] JONES G V, WHITE M A, COOPER O R, et al. Climate change and global wine quality[J]. Climatic Change, 2005, 73(3): 319-343.DOI:10.1007/s10584-005-4704-2.

[3] CHEVET J M, LECOCQ S, VISSER M. Climate, grapevine phenology,wine production, and prices: Pauillac (1800–2009)[J]. The American Economic Review, 2011, 101(3): 142-146. DOI:10.1257/aer.101.3.142.

[4] CONDE C, SILVA P, FONTES N, et al. Biochemical changes throughout grape berry development and fruit and wine quality[M]. Food, 2007, 1:1-22. DOI:10.1093/jxb/ert395.

[5] 孫明霞, 王寶增, 范海, 等. 葉片中的花色素苷及其對植物適應(yīng)環(huán)境的意義[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2003, 6: 688-694. DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2003.06.051.

[6] MAKRIS D P, KALLITHRAKA S, KEFALAS P. Flavonols in grapes,grape products and wines: burden, profile and influential parameters[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2006, 19(5): 396-404.DOI:10.1016/j.jfca.2005.10.003.

[7] FERNáNDEZ-PACHóN M S, VILLA?O D, GARCíA-PARRILLA M C, et al. Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 513(1): 113-118.DOI:10.1016/j.aca.2004.02.028.

[8] 黃星培, 鄭邦健, 王林, 等. 植物色素抗香煙氧化損傷的初步觀察[J].職業(yè)衛(wèi)生與病傷, 2001, 16(3): 136-138.

[9] BAKKER J, TIMBERLAKE C F. The distribution of anthocyanins in grape skin extracts of port wine cultivars as determined by high performance liquid chromatography[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36(12): 1315-1324. DOI:10.1002/jsfa.2740361217.

[10] CHORTI E, GUIDONI S, FERRANDINO A, et al. Effect of different cluster sunlight exposure levels on ripening and anthocyanin accumulation in Nebbiolo grapes[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2010, 61(1): 23-30.

[11] KRASNOW M, WEIS N, SMITH R J, et al. Inception, progression, and compositional consequences of a berry shrivel disorder[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2009, 60(1): 24-34.

[12] 張曉煜, 亢艷莉, 袁海燕, 等. 釀酒葡萄品質(zhì)評價(jià)及其對氣象條件的響應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 27(2): 740-745.

[13] BERGQVIST J, DOKOOZLIAN N, EBISUDA N. Sunlight exposure and temperature effects on berry growth and composition of Cabernet Sauvignon and Grenache in the Central San Joaquin Valley of California[J].American Journal of Enology and Viticulture, 2001, 52(1): 1-7.

[14] 劉笑宏, 孫永江, 孫紅, 等. 不同葉幕類型對‘摩爾多瓦’葡萄果穗微域環(huán)境及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(21): 4246-4254. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.019.

[15] 何建軍. 影響釀酒葡萄果實(shí)中花色苷結(jié)構(gòu)修飾的因素分析[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 19-22.

[16] 程國利. 浸漬酶對蛇龍珠紅葡萄酒花色苷的影響[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007: 38-40.

[17] 孫文娟. 紫薯花色苷提取、脫味、穩(wěn)定性及其結(jié)構(gòu)初步鑒定[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2015: 51-56.

[18] LOPES-DA-SILVA F, DE PASCUAL-TERESA S, RIVAS-GONZALO J,et al. Identification of anthocyanin pigments in strawberry (cv Camarosa)by LC using DAD and ESI-MS detection[J]. European Food Research and Technology, 2002, 214(3): 248-253. DOI:10.1007/s00217-001-0434-5.

[19] 成果. 微環(huán)境調(diào)控‘赤霞珠’葡萄果實(shí)花色苷代謝的研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2015: 106-109.

[20] 曹鵬. 轉(zhuǎn)色前后葡萄果實(shí)糖代謝相關(guān)酶的特性研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2004: 25-26.

[21] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. 葡萄酒,果酒通用分析方法: GB/T 15038—2006[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006:7-8.

[22] 趙世杰, 史國安, 董新純. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 1998: 85-86; 140.

[23] 耿娜娜, 李學(xué)英, 顧丁, 等. Folin-Denis分光光度法測定五倍子中單寧酸的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(29): 11848-11850.

[24] 劉蕓, 仇農(nóng)學(xué), 楊璽玉. 葡萄皮渣提取物總酚含量及體外抗氧化活性、抑菌活性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(1): 5-9.

[25] KIM H K, CHEON B S, KIM Y H, et al. Effects of naturally occurring flavonoids on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7 and their structure-activity relationships[J]. Biochemical Pharmacology, 1999, 58(5): 759-765. DOI:10.1016/S0006-2952(99)00160-4.

[26] WATERHOUSE A L, IGNELZI S, SHIRLEY J R. A comparison of methods for quantifying oligomeric proanthocyanidins from grape seed extracts[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2000, 51(4):383-389.

[27] ORAK H H. Total antioxidant activities, phenolics, anthocyanins,polyphenoloxidase activities of selected red grape cultivars and their correlations[J]. Scientia Horticulturae, 2007, 111(3): 235-241.DOI:10.1016/j.scienta.2006.10.019.

[28] 華玉波. 整形方式對赤霞珠病害和果實(shí)品質(zhì)的影響[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2010: 3-4.

[29] 賀普超. 葡萄學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 60-61; 97-99;95-103.

[30] 馬靜茹, 郁松林, 崔瑜. 不同栽培架式對設(shè)施弗雷無核葡萄產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J]. 新疆農(nóng)墾科技, 2015, 38(5): 17-18.

[31] 賈楊, 廖康, 劉曼曼, 等. 吐魯番不同栽培架式葡萄葉幕微氣候差異分析[J]. 北方園藝, 2014(9): 23-26.

[32] 張建光, 劉玉芳, 孫建設(shè), 等. 蘋果果實(shí)日灼人工誘導(dǎo)技術(shù)及閾值溫度研究[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2003, 30(4): 446-448. DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2003.04.018.

[33] 張大鵬. 栽植方式、葉幕微區(qū)氣候與葡萄生產(chǎn): 國外葡萄栽培生態(tài)生理研究進(jìn)展[J]. 葡萄栽培與釀酒, 1989(3): 42-55.

[34] 孫永江. 葡萄光系統(tǒng)Ⅱ及光合碳同化對高溫強(qiáng)光的響應(yīng)機(jī)理[D].泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016: 25-27.

[35] JACKSON D I, LOMBARD P B. Environmental and management practices affecting grape composition and wine quality: a review[J].American Journal of Enology and Viticulture, 1993, 44(4): 409-430.

[36] 郭鳳丹, 王效忠, 劉學(xué)英, 等. 植物花青素生物代謝調(diào)控[J]. 生命科學(xué), 2011, 23(10): 938-944. DOI:10.13376/j.cbls/2011.10.011.

[37] KOES R, VERWEIJ W, QUATTROCCHIO F. Flavonoids: a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways[J].Trends in Plant Science, 2005, 10(5): 236-242. DOI:10.1016/j.tplants.2005.03.002.

[38] 高燕會, 黃春紅, 朱玉球, 等. 植物花青素苷生物合成及調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 中國生物工程雜志, 2012, 32(8): 94-99. DOI:10.13523/j.cb.20120816.

[39] 于淼, 劉海峰, 王軍. ABA對葡萄花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 果樹學(xué)報(bào), 2012, 29(1): 29-35. DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.01.014.

[40] 王惠聰, 黃旭明, 胡桂兵, 等. 荔枝果皮花青苷合成與相關(guān)酶的關(guān)系研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(12): 2028-2032.

[41] MORI K, GOTO-YAMAMOTO N, KITAYAMA M, et al. Loss of anthocyanins in red-wine grape under high temperature[J]. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(8): 1935-1945. DOI:10.1093/jxb/erm055.

[42] HASELGROVE L, BOTTING D, HEESWIJCK R, et al. Canopy microclimate and berry composition: the effect of bunch exposure on the phenolic composition of Vitis vinifera L cv. Shiraz grape berries[J].Australian Journal of Grape and Wine Research, 2000, 6(2): 141-149.DOI:10.1111/j.1755-0238.2000.tb00173.x.

[43] KATAOKA I, KUBO Y, SUGIURA A, et al. Effects of temperature,cluster shading and some growth regulators on L-phenylalanine ammonia-lyase activity and anthocyanin accumulation in black grapes[J].Memoirs of the College of Agriculture-Kyoto University (Japan), 1984,124: 35-44.

[44] HRAZDINA G, BORZELL A J, ROBINSON W B. Studies on the stability of the anthocyanidin-3,5-digucosides[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1970, 21(4): 201-204.

[45] 王博. 根域限制促進(jìn)鮮食葡萄果皮花色苷合成的機(jī)制研究[D]. 上海: 上海交通大學(xué), 2013: 122-126.

[46] SPRINGOB K, NAKAJIMA J, YAMAZAKI M, et al. Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins[J]. Natural Product Reports, 2003, 20(3): 288-303. DOI:10.1039/b109542k.

[47] YONEKURA-SAKAKIBARA K, NAKAYAMA T, YAMAZAKI M,et al. Modification and stabilization of anthocyanins[M]//Anthocyanins:Biosynthesis, Functions, and Applications. New York: Springer, 2008:169-190. DOI:10.1007/978-0-387-77335-3_6.

[48] 李華, 王華, 袁春龍. 葡萄酒化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2005: 106-110.

[49] SPAYD S E, TARARA J M, MEE D L, et al. Separation of sunlight and temperature effects on the composition of Vitis vinifera cv. Merlot berries[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2002, 53(3):171-182.

[50] 趙云鵬, 陳發(fā)棣, 郭維明. 觀賞植物花色基因工程研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)通報(bào), 2003, 20(1): 51-58.

[51] NAKAYAMA T, YONEKURA-SAKAKIBARA K, SATO T, et al.Aureusidin synthase: a polyphenol oxidase homolog responsible for flower coloration[J]. Science, 2000, 290: 1163-1166. DOI:10.1126/science.290.5494.1163.

[52] KLIEWER W M, TORRES R E. Effect of controlled day and night temperatures on grape coloration[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1972, 23(2): 71-77.