Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征合并急性腦梗死患者外周血中的動態(tài)表達研究*

劉 露，高 楠

1.河北省保定市第一中心醫(yī)院神內(nèi)2科 (保定 071000)，2.河北省保定市第一中心醫(yī)院心內(nèi)1科(保定 071000)

Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征合并急性腦梗死患者外周血中的動態(tài)表達研究*

劉 露1，高 楠2

1.河北省保定市第一中心醫(yī)院神內(nèi)2科 (保定 071000)，2.河北省保定市第一中心醫(yī)院心內(nèi)1科(保定 071000)

*河北省保定市科技局科研項目(17ZF064)

目的：觀察Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)合并急性腦梗死(ACI)患者外周血中的動態(tài)表達，分析其與神經(jīng)功能缺損程度之間的關(guān)系，探討OSAHS對急性腦梗死的影響。方法：選取ACI患者160例，依據(jù)多導(dǎo)睡眠監(jiān)測結(jié)果分為觀察組(OSAHS合并ACI患者)86例，對照1組(單純ACI患者)74例，發(fā)病后24 h及7 d、14 d進行NIHSS評分，同時抽取靜脈血，另選健康體檢者80例作為對照2組，抽取空腹靜脈血1次，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測三組各時期Treg細(xì)胞在外周血中所占的百分率，以及細(xì)胞因子IL-10的表達水平。結(jié)果：ACI發(fā)病后24 h、7 d及14 d，觀察組及對照1組的Treg細(xì)胞百分率及IL-10水平均顯著低于對照2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且均隨時間呈逐漸上升趨勢，各時間點差異顯著，觀察組各時間點Treg細(xì)胞百分率及IL-10水平均顯著低于對照1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。ACI發(fā)病后24 h、7 d及14 d，觀察組及對照1組的NIHSS評分均隨時間呈逐漸下降趨勢，觀察組NIHSS評分各時間點均顯著高于對照1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論：OSAHS合并ACI患者外周血Treg細(xì)胞百分率及其細(xì)胞因子IL-10的表達水平較單純ACI患者顯著降低，呈動態(tài)變化過程，且與神經(jīng)功能缺損程度可能相關(guān)。

腦梗死目前通常被認(rèn)為由動脈粥樣硬化閉塞導(dǎo)致局部血栓形成，引起局部腦組織出現(xiàn)缺血、缺氧，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成腦損傷甚至壞死，導(dǎo)致相應(yīng)部位的神經(jīng)功能缺損。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructivesleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一種常見疾病，與許多心腦血管疾病的病理過程有關(guān)，包括高血壓和心律失常，也被認(rèn)為是腦卒中的獨立危險因素。OSAHS在腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者中普遍存在[1]。但OSAHS導(dǎo)致ACI的具體機制目前尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg細(xì)胞失衡在急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。Treg細(xì)胞分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖及合成細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎作用[2]。有研究顯示, OSAHS與CD4+CD25+Treg也可能具有內(nèi)在聯(lián)系[3]。本研究通過比較合并OSAHS的ACI患者與單純ACI患者發(fā)病后不同時間點NIHSS評分，以及外周血中Treg細(xì)胞的百分率、IL-10含量的動態(tài)變化，進一步明確Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10在OSAHS相關(guān)的ACI的發(fā)病過程中的作用。

資料和方法

1 一般資料 連續(xù)納入2015年7月至2017年6月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的首發(fā)急性腦梗死患者160例，其中男性81例，女性79例，年齡為45～75歲，平均(58±11)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①ACI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合中國急性缺血性卒中診治指南2014，且經(jīng)頭顱MRI確診；②既往無腦卒中病史；③癥狀出現(xiàn)6h內(nèi)住院治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往存在腦出血、腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血病史和(或)既往檢查發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)腫瘤或腦動靜脈畸形者；②病情危重或有意識障礙，伴有認(rèn)知功能障礙和嚴(yán)重言語障礙、聽理解障礙者，或急性腦梗死合并舌后墜患者；③符合溶栓指征且需要溶栓患者；④住院期間合并感染或近4周內(nèi)存在感染、外傷、手術(shù)史，既往長期和(或)近4周服用抗炎藥物、免疫抑制劑者；⑤合并肝、腎、心、肺等重要臟器功能不全，惡性腫瘤、內(nèi)分泌疾病、血液及免疫系統(tǒng)疾病者；⑥精神障礙既往史或家族史陽性，或不能配合睡眠檢測者；⑦隨訪丟失的患者。同期納入我院同年齡段健康體檢者80例作為健康對照，排除打鼾或睡眠呼吸暫停綜合征。與急性腦梗死組患者在年齡、性別等一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法 研究材料有流式細(xì)胞儀CytomicsFC 500(Beckman Coulter，美國)，鼠抗人CD4-FITC(BD Phar Mingen，美國)，鼠抗人CD25-PE及同型對照(BD Phar Mingen,美國)，IL-10試劑盒(RD，美國)。ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

2.1 入院后常規(guī)治療方法：160例急性腦梗死患者入院后均給予抗凝、抗血小板聚集、穩(wěn)定斑塊、腦保護、改善循環(huán)等治療，合并糖脂代謝紊亂時給予降脂、控制血糖、血壓等治療。

2.2 NIHSS評分：急性腦梗死患者入院當(dāng)時及發(fā)病第7天、第14天由經(jīng)過培訓(xùn)的神經(jīng)科醫(yī)生進行美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分。

2.3 睡眠呼吸監(jiān)測：所有急性腦梗死患者于入院當(dāng)晚行整夜睡眠呼吸監(jiān)測(PSG)。監(jiān)測當(dāng)日禁用鎮(zhèn)靜劑，禁飲酒、咖啡、濃茶等影響睡眠物質(zhì)，于21∶00進入監(jiān)測室進行PSG監(jiān)測，次日由專科醫(yī)師對各項指標(biāo)進行手工分析。

2.4 分組：依據(jù)OSAHS診斷標(biāo)準(zhǔn)及PSG監(jiān)測結(jié)果將所有急性腦梗死患者分為觀察組(合并OSAHS的ACI患者)86例，對照1組(單純ACI患者)74例，健康體檢者作為對照2組。三組對象的性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 外周血Treg細(xì)胞檢測:觀察組和對照1組受試者于發(fā)病后24 h、7 d、14 d，抽取靜脈血共5 ml，對照2組受試者只抽1次靜脈血，分成2份，一份注入EDTA-K2抗凝管，行流式細(xì)胞儀相關(guān)標(biāo)記:取清潔試管3支，第1支加入FITC及 PE標(biāo)記的同型對照各10 μl，第2支加入FITC標(biāo)記的CD4單抗和PE標(biāo)記的同型對照各10 μl，第3支加入CD4-FITC單抗和CD25-PE單抗各10 μl，然后每管加入50 μl抗凝外周血，室溫避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，室溫避光5 min，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌1次，最后加入1%多聚甲醛300 μl進行固定。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測：校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀的光路和液路，對淋巴細(xì)胞設(shè)門，F(xiàn)L1和FL2熒光通道以相應(yīng)同種型的鼠IgG染色細(xì)胞作陰陽分界線，仔細(xì)設(shè)置各熒光通道之間的熒光補償，然后檢測CD4及CD25，將熒光強度超過102的CD25陽性細(xì)胞定義為CD25+細(xì)胞，每管獲取CD4+細(xì)胞2 000～4 000個，用CXPSoftware軟件進行分析,所得Treg細(xì)胞百分率。

2.7 外周血IL-10水平檢測：另一份靜脈血，3000 r /min離心5 min，收集血清，-80 ℃冰箱短期保存待測。IL-10的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，實驗嚴(yán)格按照試劑說明書進行。準(zhǔn)備好各種試劑，各孔中加入50 ml AssayDiluent RD1W，然后分別加入標(biāo)準(zhǔn)液、血清樣品和對照200 μl，37 ℃孵育2 h；吸去液體，用清洗液洗4次；加入200μl IL-6 Conjugate，37 ℃孵育1h;吸去液體,用清洗液洗4次；加入Substrate Solution 200μl，37 ℃避光孵育20 min；加入50μl Stop Solution于各孔中，半小時內(nèi)上酶聯(lián)免疫檢測儀檢測，波長取450 nm。

結(jié) 果

1 外周血Treg細(xì)胞百分率變化 急性腦梗死發(fā)病后24 h、7 d及14 d，觀察組及對照1組受試者Treg細(xì)胞百分率均顯著低于對照2組，觀察組及對照1組受試者Treg細(xì)胞百分率均隨時間呈逐漸上升趨勢，各時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組的Treg細(xì)胞百分率各時間點均顯著低于對照1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2 外周血IL-17水平 急性腦梗死發(fā)病后24 h、7 d、14 d，觀察組及對照1組受試者IL-10水平均顯著低于對照2組，觀察組及對照1組受試者IL-10水平隨時間呈逐漸上升趨勢，各時間點差異顯著；急性腦梗死發(fā)病后24 h、7 d、14 d，觀察組IL-10水平均顯著低于對照1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

3 NIHSS評分比較 急性腦梗死發(fā)病后24 h、7 d、14 d，觀察組及對照1組受試者NIHSS評分隨時間呈逐漸下降趨勢，各時間點觀察組的NIHSS評分均顯著高于對照1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表1 三組外周血Treg細(xì)胞百分率比較(%)

注：各組內(nèi)各時間點比較，及各時間點兩組間比較，P均<0.05

表2 三組外周血IL-10水平比較(ng/L)

注：各組內(nèi)各時間點比較，及各時間點兩組間比較，P均<0.05

表3 兩組NIHSS評分變化(分)

注：各時間點兩組間比較，P均<0.05

討 論

1 Treg細(xì)胞與腦梗死 缺血性腦卒中可引發(fā)龐大的免疫反應(yīng)，包括固有免疫和適應(yīng)性免疫。固有免疫細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，他們的過度活化會釋放大量的細(xì)胞毒性分子，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，破壞血腦屏障完整性，允許更多的外周免疫細(xì)胞入侵。同時，由活化的炎性細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和化學(xué)分子又進一步補充進來，并活化更多的免疫細(xì)胞，促進腦組織持久性的損失并加重神經(jīng)功能缺損[4]。

適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的成員，特別是T淋巴細(xì)胞在缺血性腦損傷中也發(fā)揮了重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是一類特殊的T細(xì)胞亞群，它作為一種內(nèi)源性的保護機制抑制缺血性腦卒中后的炎性反應(yīng)。CD4+、CD25+Tregs可負(fù)向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，以及調(diào)節(jié)病原體和損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。Tregs通過直接接觸或釋放免疫抑制因子TGF-β和IL-10，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞[4]。

有研究表明，缺血性腦卒中患者卒中發(fā)生7d和28d循環(huán)中Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組，卒中后28 d Treg細(xì)胞比例明顯高于卒中后7 d，但仍顯著低于對照組；IL-10水平在卒中后7d顯著減少，但在卒中后28 d顯著增加，但仍低于對照組[5]。本研究中我們檢測了急性腦梗死患者不同時間點外周血中Treg細(xì)胞百分率以及血清中IL-10的水平，結(jié)果顯示，觀察組和對照1組患者Treg細(xì)胞百分率及IL-10水平各時間點均顯著低于對照2組(健康人群水平)，提示Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10的減低可能與急性腦梗死的發(fā)生有關(guān)。腦卒中患者和實驗動物在發(fā)生卒中幾天后外周血中可檢測Treg細(xì)胞含量的增加。我們的實驗中可以看到急性腦梗死發(fā)生后24 h、7 d、14 d，觀察組和對照1組受試者Treg細(xì)胞百分率及IL-10水平隨時間呈逐漸上升趨勢。有研究表明，在大腦中動脈栓塞模型建立2 h，6 h甚至24 h后，系統(tǒng)的給予純化的Treg細(xì)胞，可明顯減少導(dǎo)致腦梗死事件的發(fā)生，并將神經(jīng)功能修復(fù)的時間延長至4周以上[4]。在永久性大腦中動脈閉塞模型中，與野生型小鼠相比，IL-10基因敲除(IL-10 KO)的小鼠致死率更高[6]。預(yù)先轉(zhuǎn)入重組腺病毒載體的IL-10基因至雄性Wistar大鼠的左側(cè)大腦中動脈(對照組轉(zhuǎn)入相同載體的標(biāo)記熒光蛋白或生理鹽水)，3周后在左側(cè)大腦中動脈栓塞45 min后再次給予缺血再灌注24 h，前者可導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損評分下降，腦梗死體積明顯縮小，受損神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少[7]。因此我們的實驗中看到觀察組Tregs的百分率及IL-10水平隨急性腦梗死病程延長呈逐漸上升趨勢，而NIHSS評分呈逐漸下降趨勢，提示在腦梗死發(fā)生急性期，隨病程延長Treg細(xì)胞被大量活化，釋放大量的IL-10，發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用，從而促進組織修復(fù)及炎癥的好轉(zhuǎn)。

2 Treg細(xì)胞與OSAHS OSAHS是多種病因?qū)е滤哌^程中反復(fù)出現(xiàn)上呼吸道塌陷，進而導(dǎo)致上呼吸道部分或完全阻塞、氣流受限。因其造成了反復(fù)低氧和高碳酸血癥，進而導(dǎo)致了氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，因此成為心腦血管疾病的又一危險因素[8]。趙慧新等人研究表明，ACI合并OSAHS患者存在更高的炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮功能障礙[9]。

本研究中我們檢測了OSAHS合并ACI患者不同時間點外周血中Treg細(xì)胞百分率以及血清中IL-10的水平，結(jié)果顯示均顯著低于對應(yīng)時間點的單純ACI患者。提示OSAHS合并ACI患者腦梗死病程中，參與炎癥反應(yīng)過程的Treg細(xì)胞減少，同時釋放的IL-10減少。但觀察組NIHSS評分相同時間點均顯著高于對照1組，考慮NIHSS評分的增高與Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10的減低有關(guān)。隨病情發(fā)展及恢復(fù)，Treg細(xì)胞百分率及IL-10水平逐漸上升，呈動態(tài)演變過程，同時組內(nèi)各時間點NIHSS評分比較呈顯著降低趨勢，考慮Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的IL-10水平的變化與炎癥修復(fù)有關(guān)。但14 d腦梗死病程進入恢復(fù)期時OSAHS合并ACI患者Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的IL-10水平仍低于單純ACI患者，且NIHSS評分顯著高于單純ACI患者，考慮OSAHS合并ACI患者腦梗死病程急性期后期組織修復(fù)不良，導(dǎo)致預(yù)后不佳。

綜上所述，Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10參與了OSAHS合并急性腦梗死患者腦梗死的發(fā)生、發(fā)展及恢復(fù)階段的炎癥反應(yīng)過程，且其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)更重，神經(jīng)功能缺損程度更重，恢復(fù)更差，推測與炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的Treg細(xì)胞減少，分泌細(xì)胞因子IL-10減少，從而破壞了免疫平衡可能是此類患者病情發(fā)展的原因之一，為此類患者進一步的治療提供新的靶點。

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(收稿：2017-08-02)

DynamicchangesofTregcellsandIL-10inperipheralbloodinpatientswithacutecerebralinfarctionandOSAHS

Liu Lu,Gao Nan.Baoding No.1

Central Hospital of Hebei Province(Baoding 071000)

Objective:To observe the dynamic changes of Treg cells and interleukin-10(IL-10)in peripheral blood of patients with acute cerebral infarction and OSAHS, analyze their relationship with neurological impairment,and investigate the effect of OSAHS to ACI.Methods 160 patients with ACI were selected and divided into two groups according to PSG results.86 patients with ACI and OSAHS were enrolled in research group,and 74 patients with only ACI were enrolled in control group 1.NIHSS score was used to evaluate the neurological deficits at 24h,day 7 and day 14 after symptom onset. 3ml whole blood of each patient was collected at the same time.Flow cytometry and enzyme-linked emmunosorbent assay(ELISA)were used to detected the percentage of Treg cells and IL-10 level in peripheral blood.80 healthy people underwent physical examination were selected as control group 2.The 3ml whole blood was also collected,and the percentage of Treg cells and the IL-10 level were also detected.Results:1.The percentage of Treg cells and the IL-10 level of research group and control group1 were significantly lower than control group2 at 24h,7days and 14days after acute cerebral infarction.The trend was gradual rised with time.The results at each time spot were significantly different.The percentage of Treg cells and IL-10 level of research group were significantly lower than control group1 (P<0.05).2.The NIHSS scores of research group and control group 1 were gradually decreased from 24h,7days to 14 days after acute cerebral infarction.The NIHSS score of research group was higher than that of control group at each time spot.The difference was significant(P<0.05).Conclusion: The percentage of Treg cells and IL-10 level of patients with OSAHS and ACI are significantly lower than patients with only ACI.The results changed dynamically.Those were relative with the level of neurological impairment.

Sleep apnea,Obstructive Hypoventilation Brain infarction/physiopathology @Treg cell Interleukin-10

睡眠呼吸暫停,阻塞性 通氣不足 腦梗塞/病理生理學(xué) @Treg細(xì)胞 白細(xì)胞介素10

R362.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.006