巨噬細(xì)胞與肝癌轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后關(guān)系研究*

陳 霞，張國(guó)尊，劉瑩瑩，梁育飛，李春英，張秀剛，鄭國(guó)啟

河北省滄州市中心醫(yī)院消化內(nèi)一科(滄州 061001)

巨噬細(xì)胞與肝癌轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后關(guān)系研究*

陳 霞，張國(guó)尊，劉瑩瑩，梁育飛，李春英，張秀剛，鄭國(guó)啟

河北省滄州市中心醫(yī)院消化內(nèi)一科(滄州 061001)

*河北省滄州市科技局科技項(xiàng)目(162302166)

目的：研究巨噬細(xì)胞與肝癌轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后的關(guān)系。方法：收集行肝癌根治性切除術(shù)治療的肝癌患者90例，采用免疫組化染色法檢測(cè)組織中巨噬細(xì)胞的特異標(biāo)志物CD68和VEGF的表達(dá)，與臨床病理參數(shù)分析，并研究?jī)烧咧g的相關(guān)性。結(jié)果：CD68與VEGF在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝臟組織(P<0.05)；C-D期肝癌組織中的CD68浸潤(rùn)程度顯著高于A-B期肝癌組織(P<0.05)，存在淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織中的CD68浸潤(rùn)程度顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織(P<0.05)；A-B期肝癌組織中VEGF的表達(dá)顯著低于C-D期(P<0.05)，出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織VEGF的表達(dá)顯著高于未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；肝癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與CD68的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論：巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和VEGF的表達(dá)水平都與腫瘤轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，CD68有望成為評(píng)估肝癌進(jìn)展程度的重要指標(biāo)，也為改善肝癌預(yù)后提供了新的靶點(diǎn)。

肝癌是常見的消化腫瘤之一，是病死率較高的三種疾病之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。雖然醫(yī)療技術(shù)以突飛猛進(jìn)的速度在發(fā)展，但肝癌的治療仍是醫(yī)學(xué)難題。肝癌預(yù)后較差的原因是因?yàn)槠錁O易侵襲、轉(zhuǎn)移。隨著研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)存在于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，巨噬細(xì)胞參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)血管生成參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，在血管的生成過程中起重要作用。CD68是一種胞漿細(xì)胞系統(tǒng)，是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物之一，本研究以CD68為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，檢測(cè)CD68和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在肝癌組織中的表達(dá)，以明確巨噬細(xì)胞在肝癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料 回顧性收集2015年9月至2016年12月來我院行肝癌根治性切除術(shù)治療的肝癌患者90例，均具有完整的臨床資料，術(shù)前均未為采取任何手段的抗腫瘤治療，術(shù)后檢驗(yàn)病理標(biāo)本證實(shí)為肝癌。90例肝癌患者中，男性57例，女性33例，年齡25～76歲，平均年齡(54.92±1.34)歲；AFP≥400μg/L41例，<400μg/L 49例；分化程度：低40例，高50例；腫瘤包膜完整者30例，無腫瘤包膜60例；肝癌巴塞羅那(BCLC)分期：A-B期51例，C-D期39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；血管侵犯65例，無血管侵犯25例。本研究經(jīng)我院倫理學(xué)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

2 研究方法

2.1 CD68的表達(dá)測(cè)定：采用免疫組化染色法，免疫組化試劑盒由北京中山金橋生物公司提供。甲醛固定肝癌標(biāo)本，石蠟包埋，做成3μm厚的切片，請(qǐng)2位病理醫(yī)師按照操作步驟觀察、評(píng)分。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡下的不同視野，統(tǒng)計(jì)胞漿內(nèi)可見的棕黃色的顆粒所占的百分比，采取半定量標(biāo)準(zhǔn)[2]，<10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照片由試劑公司提供，用 PBS替代第一抗體作陰性對(duì)照。

2.2 VEGF的表達(dá)測(cè)定：隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡下的不同視野，鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比采用半積分法判定結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<5%為0分，≥5%且<25%為1分，≥25%且<50%為2分，≥50%且<75%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩項(xiàng)的乘積即為VEGF的表達(dá)結(jié)果。

結(jié) 果

1 CD68與VEGF在肝癌組織中的表達(dá) 研究結(jié)果顯示，CD68在巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中呈灶狀與片狀分布，在血管周圍集中，在肝癌組織中的表達(dá)率為94.44%(85/90)，VEGF染色為棕黃色和褐色，主要集中在細(xì)胞質(zhì)，在肝癌組織中的表達(dá)率為96.67%(87/90)。CD68與VEGF在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝臟組織。

2 肝癌組織中CD68的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 研究結(jié)果顯示，C-D期肝癌組織中的CD68浸潤(rùn)程度顯著高于A-B期肝癌組織(P<0.05)，存在淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織中的CD68浸潤(rùn)程度顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織(P<0.05)，見表1。

表1 肝癌組織中CD68與VEGF表達(dá)與臨床病理關(guān)系

3 肝癌組織中VEGF的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系 研究結(jié)果顯示，A-B期肝癌組織中VEGF的表達(dá)顯著低于C-D期(P<0.05)，出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織VEGF的表達(dá)顯著高于未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見表2。

表2 肝癌組織中VEGF的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系

4 肝癌組織中CD68與VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析 經(jīng)Sperrman相關(guān)性分析，肝癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與CD68的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.691，P<0.05)。

討 論

肝癌又稱肝細(xì)胞癌，是高發(fā)惡性腫瘤之一，而且預(yù)后差。全球每年死于肝癌的人數(shù)高達(dá)70萬，而我國(guó)每年約37萬人死于肝癌，占全球死亡人數(shù)的53%左右。雖然近年來醫(yī)學(xué)診斷和治療技術(shù)在不斷提高，但是肝癌的病死率仍居高不下[3]。目前，最具臨床診斷價(jià)值的肝癌標(biāo)志物是甲胎蛋白(AFP)，據(jù)臨床資料顯示，其和肝癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有密切關(guān)系。研究證實(shí)，AFP診斷肝癌存在20%以上的假陽(yáng)性或假陰性[4]，因此AFP對(duì)肝癌的評(píng)估價(jià)值有一定的爭(zhēng)議。目前，尋找更可靠、更準(zhǔn)確的診斷指標(biāo)是肝癌研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)，這對(duì)患者病情的有效診斷以及后期治療有重要意義。

研究顯示，腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到了重要的促進(jìn)作用[5]。而存在于腫瘤微環(huán)境中的腫瘤巨噬細(xì)胞通過影響介質(zhì)的產(chǎn)生以及周圍血管的生成來促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其對(duì)腫瘤預(yù)后有重要意義，已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)[6]。腫瘤的外周轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞不斷繁殖、運(yùn)動(dòng)、粘附、侵襲、和宿主細(xì)胞相互作用的復(fù)雜、反復(fù)的過程，而到達(dá)微環(huán)境的單核細(xì)胞在微環(huán)境的刺激下發(fā)生不同性質(zhì)的極化，其中替代性活化型巨噬細(xì)胞[7]導(dǎo)致宿主細(xì)胞免疫紊亂及免疫沉默，刺激腫瘤生長(zhǎng)因子生成，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[8]。Gouon-Evans等[9]通過乳腺癌小鼠模型發(fā)現(xiàn)，去除單核巨噬細(xì)胞，腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制。CD68是巨噬細(xì)胞特異性較高的生物標(biāo)記物，其參與組織的修復(fù)與重建，在促進(jìn)血管生成、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[10]。據(jù)陳利君等[11]報(bào)道顯示，肝癌組織中的CD68數(shù)量和肝癌繁殖活性密切相關(guān)，有望成為肝癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

據(jù)相關(guān)資料顯示，腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的刺激下會(huì)被激活表達(dá)出一系列血管生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是重要的一種[12]。巨噬細(xì)胞多聚集于厭氧環(huán)境，而腫瘤細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)需要消耗大量的氧氣，必然導(dǎo)致局部細(xì)胞缺氧和供血不足，而缺氧環(huán)境可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及炎性因子的高表達(dá)，巨噬細(xì)胞聚集，引發(fā)腫瘤細(xì)胞血管的生長(zhǎng)和繁殖[13]。血管供血是腫瘤細(xì)胞繁殖和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，研究證實(shí)，如果新生血管停止供血，那么腫瘤細(xì)胞將停止生長(zhǎng)，而內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子有非常強(qiáng)的促血管生成作用，其在促進(jìn)腫瘤新生血管生成、腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[14]。本研究通過回顧性收集90例肝癌患者的臨床資料，研究了CD68和VEGF在肝癌組織中的表達(dá)以及兩者的相關(guān)性，研究結(jié)果證實(shí)，CD68在巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中呈灶狀與片狀分布，在血管周圍集中，在肝癌組織中的表達(dá)率為94.44%(85/90)，VEGF染色為棕黃色和褐色，主要集中在細(xì)胞質(zhì)，在肝癌組織中的表達(dá)率為96.67%(87/90),CD68與VEGF在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝臟組織。90例肝癌患者中，處于A-B期的有51人，處于C-D期的有39人，出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的有52人，無淋巴轉(zhuǎn)移的有38人，經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，A-B期肝癌組織中CD68的表達(dá)、VEGF的陽(yáng)性率顯著低于C-D期；出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織中CD68的表達(dá)、VEGF的陽(yáng)性率顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移者，可見，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和VEGF的表達(dá)水平都與腫瘤轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，提示VEGF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。而作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，巨噬細(xì)胞通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移，本研究中，肝癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與CD68的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，可見，巨噬細(xì)胞是通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[15]。

綜上所述，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和VEGF的表達(dá)水平都與腫瘤轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，CD68有望成為評(píng)估肝癌進(jìn)展程度的重要指標(biāo)，也為改善肝癌預(yù)后提供了新的靶點(diǎn)。

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(收稿：2017-08-02)

Macrophagesrelationswithlivercancermetastasisandclinicalprognosis

Chen Xia,Zhang Guozun ,Liu Yingying,et al.

Cangzhou Central Hospital of Hebei Province(CangZhou 061001)

Objective: To study the relationship between macrophage and metastasis of liver cancer and clinical outcome. Methods: retrospectively collected radical resection of liver cancer treatment of the clinical data of 90 patients with liver cancer, using immunohistochemical staining method to detect macrophages in the tissues of the specific markers of CD68 and the expression of VEGF, and clinical pathological parameters analysis, and study the correlation between the two. Results: the expression of CD68 and VEGF in liver cancer tissue was significantly higher than normal liver tissue (P< 0.05); C-D cancer of the liver tissue of CD68 infiltration degree was significantly higher than A-B hepatocellular carcinoma tissue (P< 0.05), degree of lymphatic metastasis of liver cancer tissue of CD68 infiltration was significantly higher than without lymph node metastasis of liver cancer tissue (P< 0.05); A-B of VEGF expression in liver cancer tissue was significantly lower than phase C-D (P< 0.05), in lymphatic metastasis of liver cancer tissue expression of VEGF was significantly higher than without lymph node metastasis (P< 0.05); The positive expression of VEGF in liver cancer tissue was positively associated with the expression of CD68 (P< 0.05). Conclusion: macrophage infiltration degree and the expression of VEGF levels are associated with tumor metastasis and clinical stage, and VEGF expression is positively related to relationship, CD68 is expected to become an important index to evaluate the degree of liver cancer progress, also provide new targets for improving the prognosis of liver cancer.

Liver neoplasms/patholgy Macrophages Neoplasms metastasis Endothelial growth factors

肝腫瘤/病理學(xué) 巨噬細(xì)胞 腫瘤轉(zhuǎn)移 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.005