聚山梨酯80修飾的天麻素脂質(zhì)體制備研究*

穆 珺，王春柳，張 紅，劉 洋，馬虎強(qiáng)，李 曄△

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)，2.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

天麻素(gastrodin)又稱天麻苷，是天麻中的主要活性成分?！侗静輩R言》認(rèn)為，天麻“主頭風(fēng)、頭痛、癲癇強(qiáng)痙以及一切中風(fēng)”，主要用以治療癲癇、眩暈癥以及血管性疾病[1]。其中，付金花等[2]將天麻素與丹紅注射液聯(lián)用于糖尿病聯(lián)合腦梗死患者治療，結(jié)果表明，與單用丹紅注射液相比，兩者聯(lián)用能明顯減少糖尿病合并腦梗死患者神經(jīng)功能的損傷；車啟富等[3]研究了天麻養(yǎng)肝降脂湯對于原發(fā)性高血壓的臨床效果，結(jié)果表明，西藥基礎(chǔ)上聯(lián)用天麻養(yǎng)肝降脂湯安全且療效顯著。目前，含有天麻的方劑麻芎舒痛方[4]、天麻鉤藤飲[5]及頭痛寧[6]、天麻眩暈寧顆粒[7]等中成藥在臨床上廣泛應(yīng)用于眩暈、偏頭痛等疾病的治療，不良反應(yīng)小，毒副作用少。

血腦屏障作為天然的腦組織屏障系統(tǒng)，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的同時(shí)也限制了許多藥物腦靶向透過血腦屏障發(fā)揮治療作用。脂質(zhì)體是磷脂分散在水中形成的類球狀雙分子層囊泡，研究表明，脂質(zhì)體可通過多種途徑促進(jìn)藥物入腦，如被動轉(zhuǎn)運(yùn)、與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜發(fā)生膜融合或內(nèi)吞[8]。聚山梨酯80(Polysorbate-80, P-80)的毒性小且修飾后可經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用跨血腦屏障，增加藥物入腦量[9]。

本文采用薄膜-超聲法制備P-80修飾的天麻素脂質(zhì)體，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對脂質(zhì)體處方進(jìn)行優(yōu)化，并對脂質(zhì)體進(jìn)行表征，為體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料

1.1 儀 器:1260型LC(Agilent)；Sartorius BP211D 型十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯天平有限公司)；KQ-250DE超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布琦公司)；HJ-6磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)；TGL-18臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南長沙英泰儀器有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司)；ZEN3600型激光粒度儀(英國Marlvern公司)。

1.2 藥品與試劑:天麻素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110807-201306，供含量測定用，純度98%)；天麻素原料藥(純度>98%)；卵磷脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>98%)；膽固醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>95%)；P-80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯仿為分析級，水為超純水(法國，Millipore超純水系統(tǒng))，甲醇為色譜級。

2 方 法

2.1 P-80修飾脂質(zhì)體的制備:采用薄膜-超聲法制備P-80修飾的天麻素脂質(zhì)體，稱取處方量的卵磷脂、膽固醇于梨形瓶中，并依據(jù)參考文獻(xiàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照P-80:脂質(zhì)=1:10 (w/w)加入P-80，再加入適量氯仿超聲溶解后，45℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，在瓶壁形成均勻的脂質(zhì)膜，加入天麻素水溶液后手搖使脂質(zhì)膜溶解，超聲30 min，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)30%功率超聲2 min，得到澄清透明的淡藍(lán)色溶液[10]。

2.2 脂質(zhì)體包封率與載藥量測定

2.2.1 色譜條件：色譜柱為Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相甲醇-水(7:93)，檢測波長220.0 nm，柱溫30℃，流量1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10μl。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱取天麻素對照品5.20 mg，用甲醇溶解并定容，得濃度為0.52 mg/ml對照品儲備液。精密吸取適量儲備液，稀釋成濃度分別20.80、26.00、52.00、104.00、208.00μg/ml的對照品溶液，按照2.2.1條件測定并記錄峰面積。以對照品溶液濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 精密度考察:取濃度分別為26.00、52.00、104.00 μg/ml的天麻素對照品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下條件測定，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

2.2.4 穩(wěn)定性考察:取濃度為52.00 μg/ml的天麻素對照品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

2.2.5 包封率與載藥量測定:取2 ml制備好的脂質(zhì)體溶液于離心管中，4℃、1.0×104r/min，離心60 min，精密移取上清液100 μl，加水定容至2 ml。按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算包封率和載藥量。

2.3 優(yōu)化設(shè)計(jì)：選取脂質(zhì)濃度(X1)、磷脂與膽固醇比例(X2)、脂質(zhì)與藥物比例(X3)為考察因素，以包封率(Y1)與載藥量(Y2)為評價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。X1的3水平分別為6、11、16 mg/ml，X2為2:1、5:1、8:1，X3為5:1、10:1、15:1。

2.4 脂質(zhì)體形態(tài)：取制備的P-80修飾的脂質(zhì)體溶液適量，蒸餾水稀釋數(shù)倍后滴至銅網(wǎng)上，15 min后用3%磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)。

2.5 粒徑及表面電位的測定：分別取P-80修飾的納米粒溶液和未修飾的納米粒溶液適量，經(jīng)蒸餾水稀釋后，測定粒徑及Zeta電位。

結(jié) 果

1 天麻素含量測定方法考察:

以對照品溶液濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，得方程Y=28293X+14.326(r=0.9995)，表明天麻素在20.80～208.00 μg/ml線性關(guān)系良好；精密度考察結(jié)果顯示3種不同濃度天麻素對照品溶液RSD分別為0.10%，0.12%和0.09%，表明精密度良好；穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示RSD 0.21%，表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2 優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果:依據(jù)3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并以包封率(Y1)與載藥量(Y2)為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 模型擬合:采用Design Expert 8.06實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件分別對指標(biāo)Y1和Y2與各因素間的關(guān)系進(jìn)行擬合。通過對比線性與二項(xiàng)式擬合，結(jié)果顯示二項(xiàng)式擬合效果最佳，二項(xiàng)式方程。對二項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2和表3。

Y1=32.49+1.43x1-0.29x2+0.44x3-1.43x1x2+0.39x1x3-0.16x2x3+1.15x12-1.20x22+0.82x32(r=0.9455，P=0.0107)

Y2=3.25+0.15x1-0.025x2-2.16x3-0.14x1x2-0.050x1x3-0.015x2x3+0.12x12-0.12x22+1.16x32(r=0.9996，P﹤0.0001)。

由表2、3結(jié)果可得，脂質(zhì)體包封率Y1受X1、X1X2、X12、X22的影響均有顯著性，載藥量Y2受X1、X3、X1X2、X12、X22、X32的影響顯著；脂質(zhì)體包封率與載藥量的模型均有顯著性，而失擬性檢驗(yàn)均無顯著性，表明建立的二項(xiàng)式模型擬合度良好，可較好預(yù)測響應(yīng)值。

表2 二項(xiàng)式回歸模型顯著性檢驗(yàn)(包封率)

表3 二項(xiàng)式回歸模型顯著性檢驗(yàn)(載藥量)

2.3 工藝優(yōu)化：應(yīng)用Design Expert 8.06實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件繪制各因素對響應(yīng)值的三維效應(yīng)面。天麻素脂質(zhì)體的包封率Y1受X1的影響顯著，在一定范圍內(nèi)隨著脂質(zhì)濃度的增加，包封率增加；天麻素脂質(zhì)體的載藥量Y2受X1、X3的影響顯著，隨著脂質(zhì)濃度的增加，載藥量增加；隨著脂質(zhì)與藥物比例的增加，載藥量降低。根據(jù)效應(yīng)面選出各因素的最佳取值范圍，確定出最優(yōu)處方為：x1=15.95mg/ml，x2=3.09:1，x3=5:1，預(yù)測包封率Y1=35.52%，載藥量Y2=6.93%。

2.4 工藝驗(yàn)證：根據(jù)優(yōu)選的最佳工藝參數(shù)條件制備3批樣品，與模型預(yù)測值進(jìn)行比較。軟件對最優(yōu)工藝條件下，Y1與Y2的預(yù)測值分別為35.52%與6.93%，Y1與Y2的實(shí)測值分別為(35.17±0.25)%與(7.03±0.05)%，各考察指標(biāo)實(shí)測值與預(yù)測值差異較小，偏差均小于5%，表明所建立的模型方程預(yù)測性較好。

3 脂質(zhì)體表征：從圖1可得，P-80修飾前后脂質(zhì)體外觀均呈類球形。普通脂質(zhì)體與P-80修飾后的脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位結(jié)果見圖2、3。結(jié)果可得：與普通脂質(zhì)體相比，修飾后的脂質(zhì)體粒徑及多分散指數(shù)均較小，電位絕對值稍有增大，整個體系分布均勻且穩(wěn)定性相對較好。

圖1 普通脂質(zhì)體(A)與聚山梨酯 80修飾的天麻素脂質(zhì)體(B)透射電鏡圖

圖2 普通脂質(zhì)體(A)和P-80修飾(B)脂質(zhì)體粒徑分布圖

圖3 普通脂質(zhì)體(A)和P-80修飾(B)脂質(zhì)體電位分布圖

圖4 各因素與響應(yīng)值的三維圖

討 論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是基于析因設(shè)計(jì)，加上極值點(diǎn)及中心點(diǎn)而形成的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、同時(shí)具有線性與非線性擬合的特點(diǎn)，其數(shù)據(jù)結(jié)果可采用結(jié)合數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的效應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化[11-12]。與覃引等[12]，采用正交法優(yōu)化天麻素脂質(zhì)體制備工藝相比，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的因素均是連續(xù)值，最優(yōu)工藝可以是因素最大值與最小值之間的任意值，而正交試驗(yàn)則只能選擇因素的水平點(diǎn)，因而星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的優(yōu)化結(jié)果精度更高，預(yù)測性更好；同時(shí)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法還可考察各因素對響應(yīng)值、各因素間的交互作用，可較好的描述因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，理想的可到達(dá)腦部載體的粒徑一般應(yīng)≤100 nm；又有文獻(xiàn)證明[14]，分別給藥粒徑為70、170、220和345 nm的P-80修飾的納米粒，粒徑為70 nm時(shí)其腦內(nèi)藥物濃度最高，表明粒徑對藥物遞送入腦效率有一定的影響。與覃引[12]，等采用薄膜-蒸發(fā)法制備的天麻素脂質(zhì)體粒徑為327 nm相比，本文制備的脂質(zhì)體粒徑顯著減小，可能更易于通過血腦屏障，藥物到達(dá)腦部發(fā)揮治療作用。與黃靜[15]，等制備的天麻素脂質(zhì)體電位為(-1.36 ±0.57)mv相比，本文脂質(zhì)體的電位為(-14.1±0.83)mv，電位的絕對值有顯著提高，從而使脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

隨著腦膠質(zhì)瘤、抑郁、阿爾茲海默癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率逐年遞增，越來越多的研究者專注于提高藥物腦靶向的給藥系統(tǒng)研究。非離子表面活性劑，如吐溫-80、泊洛沙姆等修飾于載體表面，可通過與血液中的載脂蛋白B(Apo B)或E相互吸附，通過低密度脂蛋白(LDL)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用透過血腦屏障、并抑制P-糖蛋白將已跨過血腦屏障的載體外排，提高藥物到達(dá)腦內(nèi)靶部位濃度，達(dá)到減毒增效的目的[16]。本文通過薄膜-超聲法制備P-80修飾的天麻素脂質(zhì)體，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，為其后期體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

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(收稿：2017-12-26)