不同中藥方劑對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠的行為學(xué)影響*

方錦穎，陳光耀，何亞林，俞燕薇，施曉軍，毛 萌

北京中醫(yī)藥大學(xué)(北京 100029)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Post-traumatic stress disorder，PTSD)指在經(jīng)歷或目睹異常威脅性或災(zāi)難性心理創(chuàng)傷事件后延遲出現(xiàn)并長期存在的一種精神疾病。造成PTSD的創(chuàng)傷事件包括地震、洪水、戰(zhàn)爭、恐怖襲擊、嚴(yán)重車禍、罹患癌癥等自然災(zāi)害和人為災(zāi)難。PTSD的核心癥狀包括：創(chuàng)傷事件相關(guān)事件的反復(fù)再體驗，長期持續(xù)對創(chuàng)傷事件回避及對一般事物的麻木，警覺性的高度提高以及一系列其他的心理的消極變化。單次延長應(yīng)激(Single-prolonged stress, SPS)作為敏感化動物模型的一種，通過在造模過程中單次給予強(qiáng)烈的應(yīng)激(束縛、強(qiáng)迫游泳及乙醚麻醉)，較好的模擬了PTSD臨床患者應(yīng)激過程及發(fā)病后的癥狀。且SPS模型重復(fù)性較好且夠被抗抑郁及抗焦慮藥物改善癥狀，逐漸成為當(dāng)今研究PTSD最為常用的國際公認(rèn)動物模型之一[1]。

目前治療PTSD的藥物如5-HT再攝取抑制劑類、苯二氮卓類等藥物，僅能針對PTSD部分臨床癥狀，且具有較為明顯的副作用[2]。近年來研究表明中醫(yī)藥在治療PTSD方面，體現(xiàn)出整體調(diào)節(jié)及多靶點(diǎn)起效的優(yōu)勢，且副作用較西藥明顯減少，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[3]。在2005年中國醫(yī)藥科技出版社版《中醫(yī)臨床心理學(xué)》中，將PTSD分為肝氣郁結(jié)型、氣郁化火型、心脾兩虛型、心陰虧虛型，分別對應(yīng)推薦方劑柴胡疏肝散、丹梔逍遙散、歸脾湯、天王補(bǔ)心丹，但這些方劑對PTSD模型大鼠作用效果尚不明確[4]。本文擬通過將這些方劑與確定有良好治療效果的西藥阿普唑侖和中藥方劑溫膽湯進(jìn)行對比，通過行為學(xué)實(shí)驗以檢測這些方劑對SPS建立的PTSD大鼠模型的有效性。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗動物:雄性 Wistar 大鼠96只，體重(195.9±7.6)g，實(shí)驗動物購自斯貝福(北京)實(shí)驗動物科技有限公司；許可證號:SCXK(京)2011-0004。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±2)℃，自由飲水及進(jìn)食，實(shí)驗前前一周購入并進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗藥品:實(shí)驗方劑藥物組成及比例依據(jù)《方劑學(xué)》第二版,各方劑組成如下。溫膽湯：法半夏、竹茹、炒枳實(shí)各6 g，陳皮9 g，炙甘草3 g，茯苓4.5 g。柴胡疏肝散：炒陳皮、柴胡各6 g，川芎、制香附、炒枳殼、白芍各5 g，炙甘草3g。歸脾湯：人參、炒白術(shù)、當(dāng)歸、白茯苓、黃芪、龍眼肉、遠(yuǎn)志、炒酸棗仁各3 g，木香1.5 g，炙甘草1 g。天王補(bǔ)心丹：生地黃120 g，人參、丹參、玄參、白茯苓、遠(yuǎn)志、五味子、桔梗、當(dāng)歸、天門冬、麥門冬、炒柏子仁、酸棗仁各60 g。丹梔逍遙散：當(dāng)歸、白芍、茯苓、炒白術(shù)、柴胡各3 g，丹皮、炒梔子、炙甘草各2 g。藥品濃縮顆粒由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供并由醫(yī)院制劑室按臨床要求進(jìn)行調(diào)配成方，顆粒劑用蒸餾水配制成懸濁液，每毫升懸濁液相當(dāng)于含生藥(溫膽湯0.756 g、柴胡疏肝散1.97 g、歸脾湯1.84 g、天王補(bǔ)心丹2.06 g、丹梔逍遙散1.43g)；西藥陽性對照藥物阿普唑侖，研缽研碎后用蒸餾水配置成0.0126 mg/ml的懸濁液。配置后藥物放在4℃冰箱中備用，使用時將藥物搖勻。

1.3 儀器設(shè)備:桶狀塑料透明大鼠固定器：長25 cm，筒口外經(jīng)7 cm，內(nèi)徑5 cm，由北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教研室提供。曠場箱：立方形灰色木質(zhì)曠場箱底部(100 cm ×100 cm)、高45 cm，箱底部用黑線劃分出 25個正方形格(20 cm ×20 cm)，攝像頭置于曠場箱正上方；造模及強(qiáng)迫游泳使用水箱：底部(65 cm ×100 cm)、高80 cm的立方形紅色塑料水箱。行為學(xué)自動觀察分析系統(tǒng)：Nodule公司行為學(xué)研究設(shè)備，含計算機(jī)、攝像監(jiān)控以及 observior、ethevision 分析軟件。曠場箱、水箱及行為學(xué)自動觀察分析系統(tǒng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)免疫實(shí)驗室提供。

1.4 實(shí)驗分組:將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為8組，分別為正常對照組、模型組、溫膽湯組、柴胡疏肝散組、歸脾湯組、天王補(bǔ)心丹組、丹梔逍遙散組、阿普唑侖組，每組12只。經(jīng)檢測各組大鼠體重在同一基線水平上。

2 方 法

2.1 造 模:采用SPS法建立 PTSD 大鼠模型，包括首先將大鼠進(jìn)行2 h束縛，隨后將大鼠置于水箱中進(jìn)行20 min的強(qiáng)迫游泳，并將大鼠吹干，游泳結(jié)束15 min后將大鼠置于密閉容器中進(jìn)行乙醚麻醉，待大鼠昏迷后放在通風(fēng)處，待意識恢復(fù)后再放回鼠籠靜養(yǎng)。

2.2 給 藥:造模后每天早 8:00 對大鼠進(jìn)行灌胃，正常對照組和模型組按體重給予1 ml/100g生理鹽水；溫膽湯、柴胡疏肝散、歸脾湯、天王補(bǔ)心丹、丹梔逍遙散、阿普唑侖分別給予1 ml/100g的相對應(yīng)藥物。連續(xù)灌胃7 d后進(jìn)行行為學(xué)檢測。

2.3 實(shí)驗過程

2.3.1 大鼠體重增長數(shù):在造模前及行為學(xué)實(shí)驗結(jié)束后分別使用電子秤測量大鼠體重，后一次體重減去前一次體重即為大鼠體重增長數(shù)。

2.3.2 曠場實(shí)驗:采用底部(100 cm ×100 cm)、高45 cm的立方形灰色木質(zhì)曠場箱，曠場箱底部用黑線劃分出 25個正方形格(20 cm ×20 cm)，攝像頭置于曠場箱正上方。實(shí)驗時將動物放入箱內(nèi)底面中心，開始進(jìn)行錄像5 min，錄像過程中實(shí)驗人員離開曠場箱避免造成干擾，并觀察記錄大鼠修飾次數(shù)及修飾時間。每次實(shí)驗結(jié)束后用酒精清洗方箱內(nèi)部，以免影響下次測試。錄像結(jié)束后采用計算機(jī)軟件對錄像進(jìn)行分析，測得每組大鼠5min內(nèi)運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離等指標(biāo)[4]。

2.3.3 僵立行為測試:使用造模時水箱，將水注入箱中(水深45 cm、水溫25 ℃)，將大鼠小心放置于水箱中。大鼠在水中靜止不動，可以有輕度搖擺，但除保持必要的呼吸運(yùn)動外其他肌肉活動均消失為僵立時間。記錄5min內(nèi)大鼠時間僵立時間及次數(shù)。

結(jié) 果

1 大鼠體重增長數(shù)

模型組較正常組降低具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，溫膽湯組較之于模型組升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 大鼠體重增長數(shù)表 (g)

注：與正常組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，△P<0.01

2 曠場實(shí)驗各指標(biāo) 運(yùn)動總距離模型組較之于正常組減少具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。溫膽湯組、歸脾湯組、阿普唑侖組較之于模型組升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。穿格次數(shù)模型組較之于正常組減少具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),溫膽湯組、歸脾湯組、阿普唑侖組較之于模型組升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單次最大運(yùn)動距離模型組較正常組降低具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，天王補(bǔ)心丹、阿普唑侖組較之于升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而溫膽湯、歸脾湯較之于正常組明顯提升(P<0.01)；修飾次數(shù)與時間溫膽湯組較之于模型組升高具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 曠場實(shí)驗運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離、修飾次數(shù)與時間表

注：與正常組相比較，*P<0.05；與正常組相比較，△P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05；與模型組相比較，#P<0.01

3 各組大鼠僵立行為次數(shù)及時間情況比較 見表3。較之于正常組的大鼠，模型組、溫膽湯組、柴胡疏肝散組、歸脾湯組、天王補(bǔ)心丹組、丹梔逍遙散組、阿普唑侖組的各組大鼠僵立的次數(shù)明顯增加，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同時，與正常組大鼠比較，模型組、柴胡疏肝散組、歸脾湯組、丹梔逍遙散組、阿普唑侖組的各組大鼠僵立的時間均明顯增加，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，溫膽湯組、天王補(bǔ)心丹組的大鼠僵立的時間均增加，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 大鼠僵立行為次數(shù)及時間表

注：與正常比較，*P<0.01;與正常組比較，△P<0.05

討 論

曠場實(shí)驗是評價實(shí)驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用方法，因其能夠客觀定量地反映動物運(yùn)動自主活動能力，被廣泛應(yīng)用于焦慮相關(guān)的評估[5]。前期研究表明，在經(jīng)歷SPS后動物出現(xiàn)體重增長減少、曠場實(shí)驗自主行為及探究行為下降、僵立行為測試僵立時間及次數(shù)增加的現(xiàn)象，是大鼠生活質(zhì)量下降及焦慮、恐懼行為增加的表現(xiàn)，而造模后7 d是觀察這些改變的最恰當(dāng)時間點(diǎn)[6]。本研究對經(jīng)歷了SPS應(yīng)激7 d后模型組大鼠與正常組大鼠進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)體重增長數(shù)減少，曠場實(shí)驗運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離下降，僵立行為測試僵立次數(shù)及時間增加，提示SPS模型已成功復(fù)制。

在臨床中溫膽湯被證實(shí)在治療PTSD中具有良好的效果，同時之前多個動物實(shí)驗表明溫膽湯對SPS大鼠從行為學(xué)到分子水平均具有良好的改善作用，因而本實(shí)驗選取溫膽湯作為中藥對照藥物[7-8]。結(jié)果表明較之于模型組溫膽湯不僅能有效改善曠場實(shí)驗運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離指標(biāo)，其修飾次數(shù)、時間以及體重增長數(shù)亦增加，這些現(xiàn)象在其他各組中并未得到體現(xiàn)，提示溫膽湯在緩解SPS模型焦慮水平的同時亦有良好的整體調(diào)節(jié)作用。西藥對照阿普唑侖組、歸脾湯組較之于模型組曠場實(shí)驗運(yùn)動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動距離增加；天王補(bǔ)心丹組較之于模型組僅單次最大運(yùn)動距離增加，提示阿普唑侖組、歸脾湯組大鼠曠場實(shí)驗自發(fā)活動度增加，焦慮水平降低，而天王補(bǔ)心丹組的效果尚需進(jìn)一步驗證。

在臨床中，七情之中“驚”是PTSD發(fā)病的重要原因，猝然受驚后的病理變化，其描述的表現(xiàn)亦與PTSD的核心癥狀有諸多相似之處，故后世醫(yī)家據(jù)此認(rèn)為PTSD由驚而發(fā)，氣機(jī)紊亂及痰氣交結(jié)是其主要病機(jī)過程，而“痰”是其重要病理產(chǎn)物。溫膽湯具有理氣化痰功效，且清膽和胃兼行，理氣化痰作用于氣機(jī)紊亂、痰氣交結(jié)的病機(jī)過程，膽主司勇怯，能防御驚恐，故《素問·經(jīng)脈別論》“勇者氣行則已，怯者則著而為病也”，清膽之功使膽臟避免痰火上擾使膽能夠正常行駛其生理功能，故應(yīng)激之后給予溫膽湯可有效改善PTSD相關(guān)癥狀[9-10]。同時猝驚之后，氣機(jī)逆亂，傷脾礙胃，運(yùn)化失司，臨床病人多出現(xiàn)不欲飲食體重下降或暴飲暴食體重猛增兩種極端表現(xiàn)，而溫膽湯和胃之功可有效對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究亦表明，SPS應(yīng)激后大鼠體重增長數(shù)下降，較之于本研究其他方劑，僅有溫膽湯能夠使其恢復(fù)，體現(xiàn)了溫膽湯的整體調(diào)節(jié)功效。

歸脾湯對心脾兩虛型PTSD有良好的效果。在臨床中，PTSD患者多出現(xiàn)易驚、失眠多噩夢、舌苔白厚膩等癥狀，更傾向于膽郁痰擾的溫膽湯之證，但有部分患者亦心悸怔忡，失眠健忘，體倦乏力，面色萎黃，舌淡苔薄白，脈細(xì)弱等典型心脾兩虛之證。PTSD雖病因明確，在疾病發(fā)展過程中由于個體的差異最終呈現(xiàn)出不同癥狀，在臨床治療中應(yīng)發(fā)揮中醫(yī)辨證論治特點(diǎn)，以癥狀為辨證要點(diǎn)選取該病有效的治療方劑。

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