Mirco-CT對(duì)納米細(xì)菌大鼠腎結(jié)石的動(dòng)態(tài)觀測(cè)＊

郝志強(qiáng)，王勤章，倪 釗，錢 成，申茂磊，錢 彪

腎結(jié)石一直以來(lái)都是泌尿外科的常見(jiàn)病、多發(fā)病，根據(jù)我國(guó)2010年全國(guó)人口普查資料顯示，校正后的中國(guó)成人腎結(jié)石患病率為5.8%，其中男性患病率為6.5%，女性患病率為5.1%。臨床上對(duì)于腎結(jié)石這一疾病的研究從未中斷，大都通過(guò)構(gòu)建腎結(jié)石動(dòng)物模型，對(duì)其病因?qū)W進(jìn)行探索。既往動(dòng)物模型的構(gòu)建大多采用乙二醇、氯化銨等傳統(tǒng)造模方式，對(duì)模型腎功能損害較大。本課題組前期發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石患者患側(cè)中段尿培養(yǎng)納米細(xì)菌陽(yáng)性，而健側(cè)陰性，納米細(xì)菌（nanobacteria，NB）可能是腎結(jié)石發(fā)病的原因之一，為驗(yàn)證NB與腎結(jié)石的關(guān)系。本課題采用NB誘導(dǎo)Wistar雄性大鼠，成功制備了腎結(jié)石模型，而后，利用目前在探索高密度物質(zhì)中先進(jìn)的手段——微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro computed tomography，mirco-CT）［1］，對(duì) Wistar大鼠腎結(jié)石模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)，實(shí)時(shí)記錄模型體內(nèi)結(jié)石的形成發(fā)展過(guò)程，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取Wistar雄性大鼠60只，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)［合格證號(hào)SCXK（新）2013-0001］，兩組大鼠均先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼料來(lái)源：石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

實(shí)驗(yàn)器械：多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（BX40， 日本 Olympus公司）、Mirco-CT （sky-scan 1176，比利時(shí) Antwerpen）。

實(shí)驗(yàn)試劑：納米細(xì)菌懸濁液、0.9%生理鹽水等。

1.2 方 法

1.2.1 納米細(xì)菌的制備 納米細(xì)菌來(lái)源于腎結(jié)石患者清潔中段晨尿，收集標(biāo)本后提取并培養(yǎng)，具體操作如下：收集標(biāo)本5 ml，生理鹽水稀釋2倍后濾器過(guò)濾、離心取管底液1 ml，加入DMEM及熱滅活胎牛血清培養(yǎng)，5%CO2，37℃，28～30 d 換液 1 次，培養(yǎng)6～8周，30 d換液一次。篩選出無(wú)污染的標(biāo)本制成NB懸液。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)取材 將60只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為納米細(xì)菌組（尾靜脈注射1.2 ml NB懸液，30只）和對(duì)照組（尾靜脈注射1.2 ml生理鹽水，30只），共計(jì)處理10 W，每周每組處死3只，并取兩側(cè)鮮活腎標(biāo)本，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 Mirco-CT掃描 將獲得的標(biāo)本固定放置在放射源和攝像頭之間并使標(biāo)本在觀察通道范圍內(nèi)可見(jiàn)，然后設(shè)置觀察通道沿垂直長(zhǎng)軸作0.9°至180°旋轉(zhuǎn)，在整個(gè)掃描視野范圍中，使用mirco-CT對(duì)固定后腎進(jìn)行掃描，在skyscan軟件系統(tǒng)下設(shè)置如下掃描條件：功率 8 W、電壓 30 kV，電流 300 μA，分辨率 35 μm 2000×1336，F(xiàn)ilter=0.5 mmAL，觀察腎整體輪廓及腎中腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)是否存在高密度結(jié)石樣物質(zhì)，并進(jìn)行拍照記錄及三維平面重建，若雙側(cè)標(biāo)本均同時(shí)出現(xiàn)高密度區(qū)，僅統(tǒng)計(jì)1次，計(jì)數(shù)10 W內(nèi)每周檢測(cè)到的高密度影個(gè)數(shù)。

1.2.4 病理組織學(xué)檢查 取得標(biāo)本后，依次經(jīng)過(guò)固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固等步驟，制得Wistar大鼠NB腎結(jié)石模型病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察晶體的形成過(guò)程，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提供的腎結(jié)晶分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，0級(jí)記為陰性，Ⅰ～Ⅳ級(jí)記為陽(yáng)性，進(jìn)行綜合、統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mirco－CT檢查結(jié)果 動(dòng)態(tài)觀測(cè)1～10 W兩組所獲得標(biāo)本，對(duì)照組大鼠腎外周輪廓清晰，邊緣光滑無(wú)毛糙；三視圖圖像中腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)及腎盂輪廓清晰可見(jiàn)，均未見(jiàn)高密度影，見(jiàn)圖1。納米細(xì)菌組大鼠第6周起腎可見(jiàn)高密度區(qū)，顆粒樣高密度影分布于腎實(shí)質(zhì)中，三視圖圖像可見(jiàn)高密度顆粒狀影隨機(jī)分布于腎實(shí)質(zhì)的各截面中，見(jiàn)圖2。截至第10周末，納米細(xì)菌組大鼠腎高密度影檢出4只（陽(yáng)性率13.3%），對(duì)照組未檢出。

圖1 對(duì)照組micro-CT檢測(cè)結(jié)果

圖2 納米細(xì)菌組micro-CT檢測(cè)結(jié)果

2.2 肉眼及解剖顯微鏡觀察 取大鼠雙側(cè)腎標(biāo)本，肉眼觀，對(duì)照組大鼠腎表面光滑，剖面呈現(xiàn)暗紅色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯斑點(diǎn)顆粒；納米細(xì)菌組從第4周開(kāi)始，部分腎較對(duì)照組略有增大，剖面呈紅褐色，髓質(zhì)呈淺紅色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，腎盞及腎盂良好；第6周以后納米細(xì)菌組部分腎皮髓結(jié)構(gòu)尚清晰，但有少量散在淡黃色顆粒沉積在腎組織中，觸之有沙礫感。鏡下觀測(cè)，對(duì)照組無(wú)異常，納米細(xì)菌組可見(jiàn)晶體自腎盂向周圍呈點(diǎn)狀分布。

2.3 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 動(dòng)態(tài)觀測(cè)1～10 W兩組Wistar大鼠腎標(biāo)本，對(duì)照組大鼠腎內(nèi)無(wú)晶體沉積，未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變（圖3）。納米細(xì)菌組大鼠自第4周起，其腎病理切片可見(jiàn)灰白色晶體，這些晶體主要分布于遠(yuǎn)曲小管、近曲小管及部分腎小球，形態(tài)不一，呈散點(diǎn)狀分布，部分晶體相互連接成片或成團(tuán)分布（圖4）。10 W時(shí)計(jì)數(shù)，納米細(xì)菌組大鼠腎晶體陽(yáng)性11只 （陽(yáng)性率36.7%），對(duì)照組均為陰性；截至第10周末，納米細(xì)菌組大鼠腎晶體陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 對(duì)照組

圖4 納米細(xì)菌組

3 討論

腎結(jié)石是泌尿外科診療中的常見(jiàn)病之一，治療手段多種多樣，各種治療方法，很大程度上均可以緩解患者的病痛，但該疾病較容易復(fù)發(fā)。有研究表明，經(jīng)體外沖擊波碎石技術(shù)治療后的泌尿系結(jié)石患者的結(jié)石復(fù)發(fā)率隨著時(shí)間增長(zhǎng)而有所升高，其中第1年復(fù)發(fā)率為6.7%，至第5年則增長(zhǎng)到41.8%［2］。面對(duì)如此情況，眾多科研工作者積極致力于腎結(jié)石病因?qū)W的研究，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，大都采用構(gòu)建動(dòng)物模型這一方式。以往多采用乙二醇、氯化銨進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，構(gòu)建腎結(jié)石模型，但這種方式對(duì)腎功能損傷較大，成石較快，不利于進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。因此，設(shè)計(jì)、建立與人類腎結(jié)石成石過(guò)程相類似的動(dòng)物模型，在相對(duì)緩慢的成石過(guò)程中，動(dòng)態(tài)觀測(cè)研究，對(duì)于探討腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和延緩結(jié)石形成，尋找防治腎結(jié)石的藥物等方面就有重要的意義，據(jù)目前的資料顯示，NB是人體內(nèi)唯一可以產(chǎn)生羥基磷灰石的生物，探究其在結(jié)石形成過(guò)程中的機(jī)制，成為當(dāng)前解決結(jié)石形成這一問(wèn)題的新方向。

NB是芬蘭科學(xué)家Ciftcioglu等［3］在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種具有細(xì)胞毒作用的生物被膜的生物，并在此后檢測(cè)出該生物被膜中包含了一種可能是含有基因序列為16sr RNA的顆粒物質(zhì)［4］。

隨著對(duì)納米細(xì)菌各項(xiàng)生物學(xué)特性的不斷了解，人們發(fā)現(xiàn)NB在泌尿系結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，NB所特有的生物礦化功能［5］在臨床許多鈣化性疾病中都得到了有效驗(yàn)證，NB作為鈣化的核心［6，7］，并進(jìn)一步促進(jìn)了鈣化的發(fā)展。 并且國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者通過(guò)免疫熒光、鈣染色、相差顯微鏡、電鏡等方法在人體體液及許多組織器官中檢測(cè)到了納米細(xì)菌的存在，NB作為礦化反應(yīng)的始作俑者，在吸引并聚集的同時(shí)，還能夠侵入并破壞腎集合管的腎乳頭細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，形成結(jié)晶核心，這種晶體核心作為常見(jiàn)的結(jié)石前體，最終誘發(fā)結(jié)石形成［8，9］。

由此可見(jiàn)，結(jié)石病與NB之間的確存在著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，圍繞二者的研究也在不斷開(kāi)展，然而以往的研究更多關(guān)注于納米細(xì)菌對(duì)腎小球損害的微觀層面。缺乏從析出結(jié)晶到聚結(jié)為大體結(jié)石的宏觀動(dòng)態(tài)觀測(cè)，如此，尋求一種更加直觀立體的檢測(cè)手段，來(lái)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，亟待完善。

mirco-CT又稱微型CT、顯微CT，是一種非破壞性的3D成像技術(shù)，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)。它與普通的臨床CT相比，前者采用錐形X線束，這不僅能夠獲得真正各向同性的容積圖像，提高空間分辨率（可達(dá)微米級(jí)別），提高射線利用率，而且在采集相同3D圖像時(shí)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于普通CT。mirco-CT的高速發(fā)展主要應(yīng)用于骨組織的三維定量分析［10］，其觀察和測(cè)量骨組織相對(duì)于傳統(tǒng)的組織切片技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)［11-13］。同理，結(jié)石也具有高密度物理特性，因此在既往研究的基礎(chǔ)上，筆者大膽建立納米細(xì)菌Wistar大鼠腎結(jié)石模型，利用mirco-CT技術(shù)，建設(shè)結(jié)石模型三維立體影像學(xué)資料，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)腎結(jié)石動(dòng)態(tài)發(fā)生發(fā)展過(guò)程，從宏觀角度進(jìn)一步為研究NB形成結(jié)石提供更加直觀立體的數(shù)據(jù)支持。同時(shí)與病理組織學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行橫向比較，微觀與宏觀兩大層面，雙管齊下，為尋求結(jié)石形成機(jī)制提供新思路。

筆者將mirco-CT結(jié)果同HE染色結(jié)果進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)分析得，對(duì)照組mirco-CT未檢測(cè)到高密度影，HE切片亦未檢測(cè)到病理學(xué)改變。納米細(xì)菌組納米細(xì)菌Wistar大鼠腎結(jié)石模型mirco-CT自第7～10周，共計(jì)檢測(cè)到高密度影4只，HE切片染色技術(shù)顯示，第4周及第6～10周，共計(jì)11只晶體陽(yáng)性標(biāo)本。采用篩檢試驗(yàn)的評(píng)價(jià)這一 “金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)mirco-CT與病理組織學(xué)檢驗(yàn)兩種技術(shù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，就其靈敏度、特異度、假陰性率、假陽(yáng)性率及其Kappa值進(jìn)行計(jì)算，得出Kappa值≈0.4199，一致性較差。探究其中原因，總結(jié)如下：HE染色病理切片的觀察，是在微觀層面上，就腎病理學(xué)改變進(jìn)行檢測(cè)，得出的數(shù)據(jù)反應(yīng)腎小管上皮細(xì)胞的病理?yè)p傷程度，而mirco-CT是在宏觀角度，從結(jié)晶積累形成結(jié)石后，動(dòng)態(tài)記錄結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，由于NB在造模過(guò)程中，因其自身因素（納米細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，新陳代謝率為普通細(xì)菌的萬(wàn)分之一）導(dǎo)致結(jié)石形成緩慢，部分標(biāo)本未檢測(cè)到，可能是造模周期不足所致［14］，另外，結(jié)石的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，前期結(jié)晶數(shù)量少，尚未形成大的片狀或團(tuán)狀，難以檢測(cè)到結(jié)石高密度影，從而出現(xiàn)假陰性的可能。對(duì)于mirco-CT技術(shù)，筆者經(jīng)驗(yàn)尚且不足，參數(shù)設(shè)置等需要進(jìn)一步調(diào)整。

HE染色切片在微觀角度更能揭示納米細(xì)菌對(duì)腎小管上皮的損傷程度，mirco-CT在另一個(gè)層面，構(gòu)建了一個(gè)三維立體模型，在不破壞大體標(biāo)本的情況下，探究其內(nèi)在微觀結(jié)構(gòu)，更加的直觀與立體，可以為結(jié)石疾病的發(fā)生機(jī)制提供更為翔實(shí)的物理數(shù)據(jù)，二者相輔相成，共同探討納米細(xì)菌在腎結(jié)石形成中的作用，其效果更加優(yōu)越。納米細(xì)菌為結(jié)石病病因?qū)W的發(fā)展提供了新方向，先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)諸如mirco-CT及病理組織切片技術(shù)等，為“新方向”保駕護(hù)航，但究其內(nèi)在機(jī)制，仍然不甚明了，期待進(jìn)一步研究。

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［2017－11－17 收稿，2017－12－12 修回］