安替可膠囊對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制作用及其抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究

馬 薇，舒 慶，周 丹，趙小燕，付聯(lián)強(qiáng)，馬巖敏

西安市第九醫(yī)院藥劑科(西安 710054)

肺癌是目前人類病死率及發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤血管的生成作用在腫瘤組織的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中均起到重要的促進(jìn)作用[1]。因此，對(duì)腫瘤血管的生成作用進(jìn)行有效的抑制已成為一種臨床腫瘤治療的新型方法[2]。安替可膠囊具有解毒鎮(zhèn)痛和養(yǎng)血活血等功效，臨床常用于胃癌等多類型惡性腫瘤的治療[3]。盡管有部分研究顯示安替可膠囊對(duì)鼻咽癌等非胃腸道癌癥亦具有較好的療效，但并無動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其進(jìn)行深入證實(shí)，而對(duì)于該藥物用于肺癌治療的研究則更是鮮有報(bào)道。為此，筆者對(duì)安替可膠囊用于肺癌小鼠的治療作用進(jìn)行了研究，并對(duì)其抗血管生成作用進(jìn)行了探討，期望為肺癌的治療提供一種新的思路與方法。

材料與方法

1 儀 器 78UI型奧林匹斯顯微照相系統(tǒng)及Image-proplus 6.0 圖像分析軟件(日本奧林匹斯公司)；AS-1r型高速離心機(jī)(美國安捷倫公司)；Trans-Blot Turbo全能型半干式免疫蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 試 劑 陽性藥索拉非尼：美國SIGMA公司；羧甲基纖維素鈉：美國SIGMA公司；一抗VEGF、ADAMTS1、HIF-1α及VEGFR-2抗體：美國SIGMA公司；二抗VEGF、ADAMTS1、HIF-1α及VEGFR-2抗體：美國SIGMA公司；微量BCA蛋白定量試劑盒：武漢博士德生物科技有限公司。

3 劑 量 根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)于人體與動(dòng)物的劑量轉(zhuǎn)換公式[4]：小鼠灌胃給藥劑量(mg/kg)= 12.3×成人口服劑量(mg/kg)，安替可膠囊成人一般劑量為1.32 g/d[0.022 g/(kg·d)]，故小鼠的正常給藥劑量(mg/kg) = 0.022 g/(kg·d)×12.3 = 0.27 g/(kg·d)，并選取正常給藥劑量為低劑量組[0.27 g/(kg·d)]，2倍正常給藥劑量為高劑量組[0.54 g/(kg·d)]，而陽性藥索拉非尼成人一般劑量為0.8 g/d[0.013 g/(kg·d)]，故小鼠給藥劑量(mg/kg)= 0.013 g/(kg·d)×12.3 = 0.16 g/(kg·d)。

4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 Lewis肺腺癌細(xì)胞，40只雄性清潔級(jí)C57BL/6小鼠，體重18～22 g，鼠齡6～8周，均購自陜西省疾病控制中心。將上述小鼠平均隨機(jī)分為：模型組、陽性藥組[索拉非尼0.16 g/(kg·d)]、低劑量組[0.27 g/(kg·d)]、高劑量組[0.54 g/(kg·d)]，每組10只。所有小鼠的飼養(yǎng)條件均為食物飲水不限制，晝夜各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5 造模及給藥方法[5]將Lewis肺腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中(pH=7.2)，采用無菌注射器將Lewis細(xì)胞0.2 ml接種于各組小鼠右腋下，接種1周后腫瘤長(zhǎng)徑至7～8 mm時(shí)則造模成功。Lewis肺腺癌細(xì)胞接種1周后，將未成功造模的小鼠剔除，并對(duì)剩余小鼠進(jìn)行給藥，而模型組則灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。

6 觀察項(xiàng)目 ①各組小鼠一般情況觀察[6]：末次給藥24 h后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重，稱重結(jié)束后將小鼠脫頸法處死，取其皮下腫瘤組織，稱取瘤體重量并檢測(cè)其長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積及腫瘤抑制率，其中腫瘤體積=(長(zhǎng)徑×短徑2)/2，腫瘤抑制率=(模型組腫瘤體積-給藥組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積×100%。②各組小鼠腫瘤組織病理切片觀察：將上述各組小鼠的腫瘤組織分為兩部分，其中一部分腫瘤組織置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ａ硪徊糠帜[瘤組織則固定于4%多聚甲醛液中，以石蠟包埋、HE染色，并經(jīng)過連續(xù)切片、烤片與封片等處理后對(duì)其病理組織學(xué)進(jìn)行觀測(cè)。③各組小鼠瘤體VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α免疫熒光染色方法：?、谥斜４娴哪[瘤組織樣本，根據(jù)試劑盒說明書中VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α的免疫熒光染色方法進(jìn)行操作，采用石蠟切片脫蠟、水化，并依次進(jìn)行抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染及封片，將封好的切片放置于熒光顯微鏡中，并對(duì)其進(jìn)行拍照與統(tǒng)計(jì)。

結(jié) 果

1 安替可膠囊對(duì)各組小鼠一般情況的影響 見表1。給藥后，與模型組比較，陽性藥組、高及低劑量組體重均明顯增加，腫瘤體積與腫瘤重量則明顯降低(P<0.05)。陽性藥組、高劑量組及低劑量組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為57.8%、50.0%及40.6%。

表1 安替可膠囊對(duì)各組小鼠一般情況的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

2 安替可膠囊對(duì)各組腫瘤組織病理學(xué)的影響 見圖1。模型組腫瘤組織中癌細(xì)胞大小均勻且形態(tài)與染色均正常。陽性藥組及高劑量組小鼠腫瘤組織中則可見癌細(xì)胞出現(xiàn)大面積的壞死與凋亡，低劑量組亦出現(xiàn)壞死，但壞死程度不及陽性藥組及高劑量組。

A：模型組;B：陽性藥組;C：高劑量組;D：低劑量組 圖1 各組小鼠腫瘤組織病理切片(HE染色×200)

3 安替可膠囊對(duì)各組VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α表達(dá)的影響 見表2。模型組腫瘤組織中存在上述蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性藥組、高及低劑量組相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P<0.05)。

表2 安替可對(duì)各組VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α相對(duì)表達(dá)值的影響(%)

注：與模型組比較，*P<0.05

討 論

腫瘤的新生血管生成在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過程中均起到關(guān)鍵性作用，故抗血管生成的治療方法已成為癌癥治療的一個(gè)重要手段[7]。VEGF可通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合，而產(chǎn)生一系列促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及促進(jìn)新生血管形成等作用[8]。VEGFR-2則可刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，從而產(chǎn)生促新生血管生成作用[9]。HIF-1α能夠有效刺激腫瘤細(xì)胞合成并分泌VEGF，從而發(fā)揮促血管功能[10]。而ADAMTS1則能夠抑制腫瘤新生血管增長(zhǎng)，從而抑制腫瘤的進(jìn)一步侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。由此可見，VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α均是腫瘤新生血管生成作用中的關(guān)鍵蛋白。

索拉非尼可通過有效抑制腫瘤組織形成新生血管，故本研究采用該藥物作為陽性藥[12]。安替可膠囊主要由當(dāng)歸及蟾皮等藥材所組成，常用于胃癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤的治療[13]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，該藥物中當(dāng)歸多糖可有效抑制VEGF及VEGFR-2活性，而蟾皮的主要成分三羥丙基蝶日素則能夠抑制HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)ADAMTS1的合成與分泌[14]。鑒于安替可膠囊具有較好的抗肺癌及抗血管生成作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究檢測(cè)了其對(duì)荷瘤小鼠血管生成作用的影響，期望為該藥物的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在本研究中，高及低劑量組腫瘤體積及腫瘤重量均明顯低于模型組，且腫瘤組織中均可見不同程度的癌細(xì)胞出現(xiàn)壞死與凋亡，提示安替可能夠有效抑制小鼠腫瘤組織的增長(zhǎng)。此外，陽性藥組、高及低劑量組VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α蛋白的表達(dá)水平均明顯低于模型組，提示安替可膠囊具有較好的抗血管生成作用。然而本研究仍存在對(duì)藥物的量效關(guān)系及具體作用機(jī)制探討不清楚等問題，后期還需進(jìn)一步完善。

[1] Ri C，Wei M，Sun HL，etal.MicroRNA-224 promotes tumor progression in nonsmall cell lung cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2015，112(31): E4288-E4297.

[2] Stantic M，Sakil HAM，Zirath H，etal.TAp73 suppresses tumor angiogenesis through repression of proangiogenic cytokines and HIF-1α activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2015，112(1): 220-225.

[3] 婁彥妮，賈立群.安替可膠囊治療消化系統(tǒng)腫瘤的文獻(xiàn)分析[J].中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2013，13(9): 807-809.

[4] 孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：198-201.

[5] 李 寧，張曉曄，蔣中秀，等.小鼠Lewis肺癌原位模型的建立[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2014，22(5): 79-83.

[6] Meuwissen R，Berns A. Mouse models for human lung cancer [J]. Genes Dev，2005，19(1): 643-664.

[7] Bharathi G，Praveen B，Chandramu C，etal.Notch signaling regulates tumor-induced angiogenesis in SPARC-overexpressed neuroblastoma [J]. Angiogenesis，2013，16(1): 85-100.

[8] Goel HL，Mercurio AM.VEGF targets the tumour cell [J]. Nat Rev Cancer，2013，13(12):871-882.

[9] Luo H，England CG，Graves SA，etal.PET imaging of VEGFR-2 expression in lung cancer with64Cu-labeled ramucirumab[J].J Nucl Med，2016，57(2)：285-290.

[10] Mi HP，Kang-Yell C，Yunjin J，etal.Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1α-PHD-VHL to regulate HIF-1α stability [J]. Oncotarget，2014，5(23)：11857-11872.

[11] Shuyang C，Chengqian Y，Taotao L，etal.AMPK-HDAC5 pathway facilitates nuclear accumulation of HIF-1α and functional activation of HIF-1 by deacetylating Hsp70 in the cytosol[J].Cell Cycle，2015，14(15)：2520-2536.

[12] 安改麗，李 旭，黃尚科，等.阿帕替尼聯(lián)合順鉑對(duì)食管癌ECA109細(xì)胞抑制作用及機(jī)制探討[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2017，46(2)：148-151.

[13] 洪 衛(wèi)，朱利明，劉碧霞.安替可膠囊聯(lián)合化療治療晚期胃癌的臨床研究[J].新中醫(yī)，2014，46(6)：171-173．

[14] 林蘭娟，曾勇梅，李水云，等.黃芪扶正湯對(duì)卵巢癌術(shù)后化療患者免疫功能的影響[J].陜西中醫(yī)，2017，38(2): 217-219.