基于光纖氧氣傳感器的細胞培養(yǎng)氧分壓測試實驗

劉建斌，王誠誠，樊慧英，李 海，楊初平，曾應新，徐初東，陳榮聲，2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學 a.電子工程學院；b.獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642；2. Nuffield Department of Clinical Neurosciences, University of Oxford, Oxford OX3 9DU, UK)

一般情況下，細胞培養(yǎng)是把傳代好的細胞放入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，然后把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放入設置好溫度和二氧化碳體積分數(shù)的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng). 由于細胞在代謝過程中需要消耗氧氣，有氧氣交換過程，因此培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的蓋子不能擰緊. 在培養(yǎng)液中氧的體積分數(shù)和空氣中的氧的體積分數(shù)處于平衡狀態(tài)下，細胞的生存、繁殖、變異會受培養(yǎng)液中的氧分壓的影響[1-6]. 在平衡態(tài)下，氣相中氧氣的體積分數(shù)21%對應液相中氧分壓21kPa. 然而，在實際的細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)液中的氧分壓盡管接近21kPa，但是也要受到2個因素的影響：其一是媒質給細胞的供氧能力；其二是細胞的耗氧能力. 通常情況下，在培養(yǎng)細胞時，不會考慮培養(yǎng)液中的氧分壓，因為，在培養(yǎng)過程中會給細胞提供足夠的氧. 但是，在某些情況下，比如活體干細胞的培養(yǎng)和移植過程中，干細胞的生長對氧分壓非常敏感，2008年SimonandKeith以及Lin等研究表明，干細胞適于在低氧分壓環(huán)境下生存. 在低氧環(huán)境下，通過改變氧分壓的值，可以修改干細胞的外型[7-8]. 因此，一些研究者認為，細胞周圍的氧分壓是能夠反映細胞的功能狀態(tài)(包括細胞分化、生長、線粒體的能量代謝)的重要因素之一[3]. 因此，對細胞培養(yǎng)過程中的氧分壓進行監(jiān)測具有重要的意義.

活體外的氧分壓監(jiān)測的標準方法為Clarke-type電極法[5-6]：電極法的傳感器由電解液以及處于其中的陰極和陽極組成,電解液由外層能夠滲透氧氣的膜包圍. 當氧氣通過薄膜和電解液擴散到達陰極時,陰極附近的氫氧根離子會減少. 陰極提供電子給氧分子，同時在陰極和陽極間的電流與樣品的氧分壓成正比. 由于電極本身消耗氧氣，因此電極法測得的氧分壓值將低于實際值. 在Pettersen等的研究中[9],用微電極監(jiān)測靜態(tài)條件下的細胞培養(yǎng)的氧分壓,測量發(fā)現(xiàn)細胞周圍的氧含量和環(huán)境空氣中的氧含量有顯著差別. 另一方法是使用氧敏感的熒光體溶解在介質中測量氧分壓[1],但是敏感的熒光團可能對細胞有毒性. 以上傳感方法存在缺點(如費用高、有限的使用壽命、響應時間長等)，不適合持續(xù)監(jiān)測細胞培養(yǎng)過程中的氧分壓變化. 因為電化學傳感器本身消耗氧氣，再者溶氧敏感熒光團的組織培養(yǎng)需要遠離培養(yǎng)箱才能讀取有用的信息. 為了克服這些缺點，基于熒光淬滅的氧傳感器為測量活體外氧分壓提供了另一種選擇[10-12]. 有研究報道，把柔性的傳感器放到細胞培養(yǎng)瓶中監(jiān)測氧分壓值[13]，但是大體積的光學系統(tǒng)很難放入傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)箱中.

本文介紹將光纖氧氣傳感器用于監(jiān)測培養(yǎng)液中細胞的氧分壓的實驗方法. 以含鉑金Pt(Ⅱ)的復合物，Platinum-Octaethyl-Porphyrin(PtOEP),作為氧傳感發(fā)光材料，以聚乙烯(甲基丙烯酸乙酯，PEMA)作為基體固定發(fā)光體. 把氧傳感發(fā)光材料涂覆在圓柱形光纖的拋光面上，光纖后端有光纖分接頭，可以與LED激發(fā)光源和計算機處理系統(tǒng)相連，這樣就組成了基于光纖氧傳感器的細胞培養(yǎng)氧分壓的監(jiān)測系統(tǒng). 該系統(tǒng)可以測量液相中的氧分壓變化，實驗結果表明：細胞密度越高,處于空氣環(huán)境的培養(yǎng)液中的氧分壓越低.

1 原理與方法

1.1 原理

光纖氧氣傳感器的基本原理是基于氧氣的熒光淬滅. 在動態(tài)的淬滅過程中，發(fā)光強度和發(fā)光壽命都與氧氣的體積分數(shù)有關，而且滿足Stern-Volmer[14]關系：

1.2 光纖氧氣傳感器

1.2.1 高分子材料

為了獲得傳感器的最佳性能，預先研究了不同聚合物基體材料對傳感器的敏感度和響應時間的影響[15]. 使用甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、甲基丙烯酸乙酯(PEMA)和甲基丙烯酸丙酯(PPMA)作為基體固定鉑金Pt(II)復合物. 實驗研究結果表明：以PEMA為基體的傳感器在敏感度和信噪比方面要優(yōu)于PMMA和PPMA. 此外，還測試了CO2分壓對PEMA傳感器的敏感度和響應時間的影響. 實驗結果表明：把傳感器分別放在CO2分壓為0和5 kPa的水中，看不到CO2分壓對PEMA傳感器的敏感度和響應時間有任何影響[8]. 因此，選定高分子材料PEMA作為基體固定發(fā)光體.

1.2.2 傳感器的制作

在傳感器制作中，PtOEP和PEMA分別作為發(fā)光體和基體材料，使用二氯甲烷作為溶劑溶解發(fā)光體和基體材料. 混合液的配制：1 mg PtOEP，100 mg PEMA，1 mL二氯甲烷. 把配比好的混合液放到1.5 mL的玻璃瓶中，用聚丙烯蓋子蓋好. 攪動玻璃瓶確保PEMA和PtOEP充分溶解在溶劑中. 去掉單模多模石英光纖的端截面處的氟化聚合物包覆層，然后用異丙醇清潔和裂解，接著浸漬在10 mL的PEMA和PtOEP的混合液中以形成傳感頭. 光纖的規(guī)格是：無水光纖(Low OH)，高數(shù)值孔徑0.43，長2.5 m，芯徑200 μm. 傳感頭放到空氣中干燥至少24 h.

1.2.3 傳感器的穩(wěn)定性

傳感器系統(tǒng)包括海洋光學公司提供的LED光源和接收系統(tǒng)，以及自制的傳感頭. 光纖傳感器產(chǎn)品的穩(wěn)定性測試是通過連續(xù)測量光傳感元件的發(fā)光壽命在室內(nèi)空氣環(huán)境中要超過100 h. 圖1所示為117 h熒光壽命的測量數(shù)據(jù)，結果表明該傳感器的性能穩(wěn)定,在117 h內(nèi)發(fā)光壽命的變化小于0.65 μs.

圖1 傳感器隨時間的穩(wěn)定性測試圖

1.3 細胞培養(yǎng)

實驗使用豬腎細胞(PK-15). 先把傳代好的細胞放到培養(yǎng)液中，再放入溫度為37 ℃、CO2的體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng). 當培養(yǎng)瓶中的細胞長滿70%～80%時(一般2～3 d)，就要進行細胞傳代. 當細胞長滿90%～100%時即可進行實驗.

準備5個培養(yǎng)瓶，分別滴入0，1，2，3，4 mL的細胞培養(yǎng)液，然后，加入消化液使每個培養(yǎng)瓶的體積都是5 mL. 接著將5個細胞培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱2 h,準備進行測試.

2 實驗與結果

2.1 傳感器定標

使用發(fā)光相位檢測系統(tǒng)在液體測試瓶中進行定標. 定標過程中，水可以作為液體定標的參考介質. 把光纖氧氣傳感端伸入37 ℃充滿O2和N2的混合氣體的液體測試瓶中. O2和N2的混合體積比例是0/100,2/98,5/95,15/85,21/79,40/60,分別對應測試液體的氧分壓為0,2，5，15，21，40 kPa.

定標曲線如圖2所示，圖2顯示了用光纖氧氣傳感器測試的37 ℃測試液中發(fā)光壽命隨氧分壓變化的情況.

圖2 37 ℃下熒光壽命隨氧分壓變化曲線及熒光壽命隨氧分壓變化響應曲線

2.2 細胞培養(yǎng)氧分壓測試

圖3是實驗裝置示意圖，LED光源是美國海洋公司(OCEAN OPTICS)生產(chǎn)的NeFox熒光探測器.

在細胞培養(yǎng)的實驗室進行細胞培養(yǎng)氧分壓測試實驗. 實驗中光纖氧氣傳感器的傳感頭放置在細胞培養(yǎng)瓶的固定位置，并且靠近培養(yǎng)瓶的底部. 5個不同細胞密度的培養(yǎng)瓶分別放置在有玻璃罩的環(huán)境溫度為37 ℃的實驗平臺上(該實驗平臺具有殺菌和消毒功能). 每個培養(yǎng)瓶中的氧分壓使用發(fā)光相位測量系統(tǒng)(NeroFox)進行測量，測量數(shù)據(jù)記錄在電腦里. 在每個培養(yǎng)瓶的底部附近測量了幾個數(shù)據(jù)點，得到每組數(shù)據(jù)的測量平均值為氧分壓值.

圖3 實驗裝置示意圖

圖4顯示了不同時間的5個不同細胞密度的氧分壓數(shù)據(jù)記錄結果. 記錄過程中，先測量細胞密度比較小的培養(yǎng)瓶，再依次測量細胞密度大的培養(yǎng)瓶. 細胞密度的大小可以在細胞培養(yǎng)過程中，通過傳代細胞實現(xiàn). 從圖4中可以看出，隨著細胞密度的增加，細胞消耗的氧增加，從而使氧分壓降低.

圖4 不同PK-15的細胞密度下氧分壓隨時間變化情況

2.3 細胞計數(shù)

測量5個細胞培養(yǎng)液樣品的氧分壓后，使用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化這些細胞樣品約5 min，然后在5 mL細胞培養(yǎng)基(DMEM)中重新懸浮培養(yǎng). 取大約20 μL的細胞懸液用于細胞計數(shù)系統(tǒng)進行計數(shù). 計數(shù)系統(tǒng)的儀器型號是Counter Star System，該系統(tǒng)可以很好地估計出5個培養(yǎng)液中細胞的數(shù)量. 表1為使用光纖氧氣傳感器測量的氧分壓值和在每個細胞培養(yǎng)瓶中的PK-15細胞密度.

表1 氧分壓值和在每個細胞培養(yǎng)瓶中的PK-15細胞密度

3 結 論

以PK-15細胞為實驗樣品，對細胞周圍的氧分壓值進行了測試. 實驗結果表明:隨著細胞密度的增高，測得的氧分壓的數(shù)據(jù)越小. 通過與細胞計數(shù)的結果進行對比，也實驗證明了光纖氧氣傳感器能夠對培養(yǎng)液中細胞周圍的氧分壓進行監(jiān)測,細胞培養(yǎng)中液相中的氧分壓水平不僅依賴于細胞培養(yǎng)環(huán)境氣相中的氧分壓，而且也依賴于細胞的密度和細胞代謝. 因此在細胞培養(yǎng)過程中需要監(jiān)視和控制氧分壓水平，以維持在一般生理條件下的細胞培養(yǎng)，并且使實驗條件具有可復制性和可比性.

參考文獻：

[1] Swartz H M. On tissue oxygen and hypoxia [J]. Antiviral Therapy, 2007,12(2):1111-1113.

[2] Demas J N, Degraff B A, Coleman P B. Oxygen sensors based on luminescence quenching [J]. Anal. Chem., 1999,71(23):793A-800A.

[3] Weiszenstein M, Pavlikova N, Elkalaf M, et al. The effect of pericellular oxygen levels on proteomic profile and lipogenesis in 3T3-L1 differentiated preadipocytes cultured on gas-permeable cultureware [J]. Plos One, 2016,11(3):e0152382.

[4] Clark L C Jr, Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery [J]. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1962,102(1):29-45.

[5] Hahn C E. Electrochemical analysis of clinical blood-gases gases and vapours [J]. Analyst, 1996,123(6):57R-86R.

[6] Oqino H, Asakura K. Development of a highly sensitive galvanic cell oxygen sensor [J]. Talata, 1995,42(2):305-310.

[7] Lin Q, Kim Y, Alarcon R M, et al. Oxygen and cell fate decisions [J]. Gene Regul. Syst. Biol., 2008,2(2):43-51.

[8] Simon M C, Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function [J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2008,9(4):285-296.

[9] Pettersen E O, Larsen L H, Ramsing N B, et al. Pericellular oxygen depletion during ordinary tissue culturing, measured with oxygen microsensors [J]. Cell Proliferation, 2005,38(4):257-267.

[10] Chen R S, Farmery A D, Obeid A, et al. A cylindrical-core fibre-optic oxygen sensor based on fluorescence quenching of a platinum complex immobilized in a polymer matrix [J]. IEEE Sensors Journal, 2012,12(1):71-75.

[11] Sharma A, Wolfbeis O S. Unusually efficient quenching of the fluorescence of an energy transfer-based optical sensor for oxygen [J]. Anal. Chim. Acta, 1998,212(1/2):261-265．

[12] Choi M M F, Xiao D. Linear calibration function of luminescence quenching-based optical sensor for trace oxygen analysis [J]. Analyst, 1999,124(5):695-698．

[13] Chen R, Hahn C E, Farmery A D. A flowing liquid test system for assessing the linearity and time-response of rapid fibre optic oxygen partial pressure sensors [J]. Respiratory Physiology & Neurobiology, 2012,183(2):100-107.

[14] Kojima M, Takehara H, Akagi T, et al. Flexible sheet-type sensor for noninvasive measurement of cellular oxygen metabolism on a culture dish [J]. Plos One, 2015,10(12):e0143774.

[15] Chen R, Formenti F, McPeake H, et al. Experimental investigation of the effect of polymer matrices on polymer fibre optic oxygen sensors and their time response characteristics using a vacuum testing chamber and a liquid flow apparatus [J]. Sensors and Actuators B Chemical, 2016,222(169):531-535.