粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

郭清華，熊本濤，陳少林*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)生物質(zhì)能研究中心，陜西 楊陵 712100)

絲狀真菌再經(jīng)長(zhǎng)期的自然進(jìn)化之后，成為降解植物生物質(zhì)最有效的來(lái)源，也是目前商業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)的主要菌種，如Trichodermareesei(Hypocreajecorina)[1]。粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)作為一種模式生物已被研究幾十年之久[2]，近些年來(lái)在纖維素降解以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白方面取得了極其顯著的成就[3-5]，并且含有里氏木霉(Trichodermareesei)2倍多的纖維素基因，可參與生物質(zhì)降解[6]，而且國(guó)內(nèi)外科學(xué)家亦從工業(yè)生產(chǎn)角度對(duì)粗糙脈孢菌進(jìn)行研究，其中包括粗糙脈孢菌產(chǎn)乙醇發(fā)酵[7]與蛋白表達(dá)[8]，其中山東大學(xué)曲音波教授對(duì)粗糙脈孢菌黑色素分泌以及木糖發(fā)酵等做出了系統(tǒng)研究[9-10],為使其更好地生產(chǎn)纖維素酶，本試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化以提高其產(chǎn)量。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中培養(yǎng)條件中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，可以將多個(gè)變量影響的問(wèn)題進(jìn)行建模與分析，并根據(jù)其響應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，與傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)法(one variable at a time)、正交設(shè)計(jì)法(orithogonal design)等相比，具有縮短優(yōu)化時(shí)間以及提高其可信度等優(yōu)點(diǎn)，一般可以運(yùn)用placett-burman(PB)設(shè)計(jì)法或者central composite design(CCD)設(shè)計(jì)法[11-12]。顧芮萌[13]等利用響應(yīng)面分析法對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并將酶活提高2.08倍；同時(shí)，響應(yīng)面分析也被用作哈茨木霉培養(yǎng)基優(yōu)化[14]以及光葉蛋白提取工藝研究[15]。本試驗(yàn)采用粗糙脈孢菌野生型菌FGSC2498作為研究對(duì)象，通過(guò)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)優(yōu)化試驗(yàn)中各因素影響提高纖維素酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)野生型菌株FGSC2489購(gòu)自FGSC。

1.1.2 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基(L)：2% Vogel's salts，20 g蔗糖，12 g瓊脂粉，自然pH。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(L)：2% Vogel's salts，20 g微晶纖維素(Avicel)，自然pH。

Vogel's salts(L)：3.76 g CaCl2，126.72 g C6H5Na3O7，250 g KH2PO3，100 g NH4NO3，10 g MgSO4·7H2O，5 mL trace elements，2.5 mL 0.1 g/L生物素溶液。

Trace elements(L)：50 g C6H8O7·H2O，0.5 g Na2MoO4·2H2O，50 g ZnSO4·7H2O，10 g Fe(NH4)(SO)2·6H，2.5 g CuSO4·5H2O，0.5 g MnSO4·H2O，0.5 g H3BO3。

1.1.3 儀器與設(shè)備 TECAN infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，上海南榮NRY-2112搖床，MAPADA UV-1800紫外分光光度計(jì)，BIO-RAD T100 Thermal Cycler。

1.2 方法

1.2.1 粗糙脈孢菌培養(yǎng)方法 把整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分成：菌絲生長(zhǎng)階段(利用蔗糖-Vogel's培養(yǎng)基培養(yǎng)粗糙脈孢菌菌絲)和纖維素酶誘導(dǎo)階段(利用Avicel- Vogel's培養(yǎng)基誘導(dǎo)纖維素酶)，有利于提高纖維素酶的得率。具體方法如下：

在250 mL錐形瓶裝入50 mL蔗糖-Vogel's液體培養(yǎng)基，接入適當(dāng)體積的孢子懸液，使孢子懸液終濃度OD600=0.04，于30℃、200 r/min,暗光培養(yǎng)24 h，將菌絲過(guò)濾后，接入50 mL/250 mL Avicel-Vogel's培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶。

1.2.2 纖維素酶活性及蛋白濃度測(cè)定 總蛋白的濃度測(cè)定(Bradford試劑盒法)：取10 μL上清液加入96酶標(biāo)板微孔中，再加入100 μL Coomassie Brilliant Blue dye,置于Tecan酶標(biāo)儀，混勻后，靜止反應(yīng)5 min,在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其OD值，以BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算成蛋白質(zhì)濃度。

FP酶活的檢測(cè)：在96孔板微孔中加入90 μL 0.1 μmol·L-1乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)，后加入90 μL上清液，最后再加入1張直徑為5 mm的濾紙片，于水浴鍋中50℃反應(yīng)16 h。取50 μL上述反應(yīng)液加入另一96微孔板孔的微孔中，再加入100 μLDNS反應(yīng)液，在PCR儀100℃反應(yīng)5 min。取36 μL上述反應(yīng)液于酶標(biāo)版，加入160 μL 0.1 μmol·L-1乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)測(cè)量其OD值，通過(guò)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其還原糖濃度和酶活。

CMC酶活的檢測(cè)：在96孔板微孔中加入50 μL 2% CMC溶液，然后再加入50 μL上清液接，于水浴鍋中50℃反應(yīng)30 min。再向上述反應(yīng)液加入100 μL DNS溶液，在PCR儀100℃反應(yīng)5 min。取36 μL上述反應(yīng)液加入到酶標(biāo)版的微孔中，最后加入160 μL 0.1 μmol·L-1乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)測(cè)量其OD值，通過(guò)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其還原糖濃度和酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design Expert 8.0軟件的CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)溫度、pH、轉(zhuǎn)速等各因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平如表1所示。

利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，分別以濾紙酶活(FPase)活性、羧甲基纖維素酶活(CMCase)活性以及蛋白濃度(protein concentration)為響應(yīng)值，以溫度、pH值、轉(zhuǎn)速為因變量，設(shè)計(jì)了20次試驗(yàn)以?xún)?yōu)化試驗(yàn)條件，得到的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，并對(duì)響應(yīng)面曲面函數(shù)進(jìn)行擬合。

通過(guò) Design Expert 8.0軟件對(duì)表 2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表 3為方差分析結(jié)果。以蛋白濃度為響應(yīng)值，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立回歸模型?；貧w方程為：

Y=145.55+9.05A+2.60B-3.03C+1.54AB-5.01AC+0.65BC+1.55AA-2.25BB-0.39CC

(1)

以濾紙酶活性為響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=0.80+0.19A+0.111 43B-0.175 87C+0.026 288AB-0.104AC+0.024 20BC-0.054 612AA-0.117BB-0.024 39CC

(2)

以羧甲基纖維素作為底物的酶活性相應(yīng)值方程為：

Y=1.46+0.12A-6.520E-003B-0.070C-9.986E-003AB-0.14AC+0.048BC-0.16AA-0.11BB+7.635E-003CC

(3)

表2 不同獨(dú)立變量對(duì)響應(yīng)值的影響

表3 回歸方程方差分析

由表3可以看出，回歸模型的F值為16.19，P<0.001，表明此模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)(Lack of Fit)的P=0.955 1>0.05，由此說(shuō)明失擬項(xiàng)差異并不顯著，本試驗(yàn)無(wú)失擬因素的存在，能準(zhǔn)確反應(yīng)實(shí)際情況，回歸模型沒(méi)有問(wèn)題。而試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=1.42/1.51=0.940 39，說(shuō)明酶活及蛋白濃度與模型預(yù)測(cè)有很好的一致性，因此試驗(yàn)結(jié)果可靠，此模型及回歸方程可以對(duì)酶活及蛋白濃度進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)?；貧w方程中各項(xiàng)方差分析F檢驗(yàn)值可以判斷出本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各個(gè)自變量及其交互相對(duì)因變量的影響。由表2、表3可得，溫度與轉(zhuǎn)速對(duì)響應(yīng)值的影響最為顯著，雖然pH對(duì)響應(yīng)值的影響較弱，但仍是極其顯著；而交叉項(xiàng)中，溫度與轉(zhuǎn)速有顯著影響，而其余的2種交互相對(duì)結(jié)果的影響不顯著；二次項(xiàng)中pH對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到顯著水平，而溫度與轉(zhuǎn)速對(duì)其影響不甚明顯。

2.2 響應(yīng)面分析

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析得到的響應(yīng)面圖，響應(yīng)面圖示根據(jù)試驗(yàn)因素因素溫度及轉(zhuǎn)速與響應(yīng)值CMC酶活、FP酶活、蛋白濃度構(gòu)成三維曲面圖。

由圖1～圖3可知，溫度與pH對(duì)響應(yīng)值的影響不甚明顯，并且可以得出溫度為22.5℃、pH為6.25、轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，CMCase達(dá)1.23 mg/L,FPase達(dá)1.55 mg/L,蛋白濃度達(dá)162.349 mg/L,可以較高地提高粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的能力。

圖1 溫度與pH對(duì)粗糙脈孢菌濾紙酶活的影響的等溫線(xiàn)與響應(yīng)面分析

圖2 溫度與pH對(duì)粗糙脈孢菌CMC酶活的影響的等溫線(xiàn)與響應(yīng)面分析

圖3 溫度與pH對(duì)粗糙脈孢菌蛋白濃度的影響的等溫線(xiàn)與響應(yīng)面分析

2.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

表4為原始培養(yǎng)條件與優(yōu)化后培養(yǎng)條件產(chǎn)酶結(jié)果對(duì)比，每個(gè)條件分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，初始產(chǎn)酶條件為溫度25℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min、pH 6.0。從表4可以看出，優(yōu)化后培養(yǎng)條件將CMCase提高34.4%，F(xiàn)Pase提高60%，蛋白濃度提高11.22%，極大地提高了FP酶活。

表4 模型試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法對(duì)粗糙脈孢菌這一模式菌株進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，使其提高產(chǎn)纖維素酶的能力。根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的3因素20次試驗(yàn)的結(jié)果得出，溫度為20℃、pH為6.25、轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，可以較高地提高粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的能力,此時(shí)CMCase達(dá)1.230 mg/L，F(xiàn)Pase達(dá)1.550 mg/L,蛋白濃度達(dá)162.349 mg/L。

在發(fā)酵條件試驗(yàn)的3個(gè)控制因素中，溫度、轉(zhuǎn)速對(duì)響應(yīng)值的影響最為顯著，其次是pH，轉(zhuǎn)速對(duì)響應(yīng)值的影響比pH顯著。轉(zhuǎn)速可以影響發(fā)酵過(guò)程中的通氣量，溶氧水平隨著轉(zhuǎn)速的提高而增加，溶氧水平可以極大促進(jìn)粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)酶。同時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速升高，產(chǎn)生的作用力極易打斷粗糙脈孢菌菌絲體，不利于發(fā)酵產(chǎn)酶[16]。

本試驗(yàn)所使用的是搖瓶培養(yǎng)法，錐形瓶中條件控制較為欠佳，所以?xún)?yōu)化后的粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶能力的提高并不明顯。而后期試驗(yàn)中計(jì)劃將其接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中更為精密的控制條件及攪拌過(guò)程中更為充分的溶氧率，必能更好地提高粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的能力。

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