不同草莓品種無菌苗增殖及不定芽誘導(dǎo)的研究

張立磊，李桂榮*，張 浩，金萬梅

(1.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 林業(yè)果樹研究所，北京 100093)

草莓(Fragariaananassa)栽培面積和產(chǎn)量在世界漿果類水果生產(chǎn)中僅次于葡萄[1-2]。草莓具有適應(yīng)性廣，栽培容易、結(jié)果早、產(chǎn)量高、收益好等優(yōu)點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的高檔食品，草莓主要是通過種子、分株和匍匐莖等形式繁殖[3]，但是現(xiàn)在引進(jìn)的草莓資源多數(shù)倍性較高，遺傳上高度雜合，植株分生少，不發(fā)達(dá)，用分株方法繁殖系數(shù)較低，而且通過常規(guī)育種和繁殖途徑改良某些不良性狀并加速繁殖受到很大限制[4-5]，生物技術(shù)的應(yīng)用為草莓育種和快繁開辟了一條新的途徑，如何提高草莓離體培養(yǎng)增殖率及在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)其再生率和再生芽數(shù)是需要不斷改進(jìn)的技術(shù)問題[6-7]。

影響草莓增殖及再生頻率的高低因素很多，如材料因素、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等。材料因素包括材料的基因型、生理狀態(tài)等，其中材料生理狀態(tài)對(duì)于誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生有較大影響[8-12]。本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過在離體培養(yǎng)下，采用4個(gè)不同草莓品種的無菌苗，經(jīng)過不同時(shí)間進(jìn)行繼代培養(yǎng)，研究基因型和繼代時(shí)間對(duì)增殖倍數(shù)的影響，同時(shí)對(duì)獲得的無菌苗采用葉片和葉柄2個(gè)部位的材料，接種到不同培養(yǎng)基上進(jìn)行再生分化誘導(dǎo)，獲得了大量的不定芽，為草莓離體增殖培養(yǎng)及再生體系的建立提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4種草莓品種(紅顏、章姬、美香莎、哈尼)無菌苗由北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 增殖培養(yǎng) 將4種草莓的無菌苗(株高1.5～2 cm)，接種到增殖培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA+6 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖)上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代增殖時(shí)間分別為14、21、28 d。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 采用葉片和葉柄為材料，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上30 d。葉片處理：選擇無菌苗上幼嫩、平展的葉片，剪成的長(zhǎng)、寬分別為0.3 cm，接種時(shí)所有的葉片都是背面朝下放置。葉柄處理：選擇無菌苗上顏色嫩綠的基部大約1 cm長(zhǎng)的葉柄部分，剪成長(zhǎng)度為0.5 cm。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：R1：MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1IBA+6 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖；R2：MS+3.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-12.4-D+6 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基pH值均為6.0。培養(yǎng)條件為16 h(光)/8 h(暗)，光強(qiáng)2 000～3 000 lx，溫度23～25℃。

1.3 觀察統(tǒng)計(jì)

增殖培養(yǎng)時(shí)，每7 d觀察1次，記錄增殖倍數(shù)、生根數(shù)(條)、愈傷組織生長(zhǎng)情況及葉片生長(zhǎng)情況，增殖倍數(shù)=繼代后增殖數(shù)/接種外植體總數(shù)。培養(yǎng)30 d后進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，再生培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)再生率、再生芽數(shù)及玻璃化率。再生率=(再生不定芽外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；玻璃化率=玻璃化總數(shù)/外植體總數(shù)×100%。采用Excel2003和DPS9.50進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同草莓品種無菌苗的增殖生長(zhǎng)

由表1可以看出，不同草莓品種增殖倍數(shù)不同，紅顏草莓增殖倍數(shù)最高，為7.767，與其他3個(gè)品種增殖倍數(shù)差異顯著(P<0.05)，哈尼草莓增殖倍數(shù)最低，僅為3.333。紅顏草莓的生根數(shù)也最多，達(dá)11.1個(gè)，與其他3個(gè)品種生根數(shù)差異顯著(P<0.05)，章姬草莓和美香莎草莓生根數(shù)差異不顯著(P>0.05)，哈尼草莓的生根數(shù)最少，為6.767個(gè)。誘導(dǎo)增殖過程中，紅顏和章姬不易產(chǎn)生愈傷組織，伸展的葉片正常，紅顏葉大而平展，綠色，葉厚，而美香莎和哈尼易產(chǎn)生愈傷組織，葉片伸展?fàn)顩r不佳，美香莎葉下垂不展，淺綠，少數(shù)發(fā)黃，哈尼葉小平展，葉薄，下部發(fā)黃，說明增殖過程中愈傷組織的產(chǎn)生不利于根及葉片等其他器官的發(fā)育生長(zhǎng)。

表1 不同草莓品種無菌苗的增殖生長(zhǎng)

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

另外，由表1還可以看出，4個(gè)品種隨著時(shí)間的增加，增殖速率相差較大，同一時(shí)間內(nèi)，紅顏增殖速率較快，繼代培養(yǎng)14 d，增殖倍數(shù)為3.870，而哈尼較低，增殖倍數(shù)僅為2.2；繼代培養(yǎng)21 d，紅顏的增殖倍數(shù)較高，為6.133，而哈尼的較低，增殖倍數(shù)僅為2.552；繼代培養(yǎng)28 d，紅顏的增殖倍數(shù)仍然最高，為7.767，哈尼的增殖倍數(shù)僅為3.333。同一品種隨著增殖培養(yǎng)時(shí)間的增加，增殖倍數(shù)隨著增加，紅顏繼代培養(yǎng)28 d的增殖倍數(shù)比14 d增殖倍數(shù)高3.967，章姬繼代培養(yǎng)28 d的增殖倍數(shù)比14 d增殖倍數(shù)高2.333，美香莎繼代培養(yǎng)28 d的增殖倍數(shù)比14 d增殖倍數(shù)高1.266，哈尼繼代培養(yǎng)28 d的增殖倍數(shù)比14 d增殖倍數(shù)高1.133，同時(shí)也可以看出紅顏增殖速率較快。

2.2 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)4個(gè)草莓品種不同部位不定芽的生長(zhǎng)

2.2.1 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)4個(gè)草莓品種葉片不定芽的生長(zhǎng) 由表2可知，4種不同品種繼代材料葉片在同一培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生分化不同，紅顏草莓再生頻率最高，為74.53%，哈尼草莓的為71.33%，與紅顏草莓的差異不顯著(P>0.05)美香莎的再生頻率最低，為54.07%，與紅顏草莓的差異顯著(P<0.05)，紅顏草莓每葉片平均再生芽數(shù)也最多，為2.98個(gè)，與其他3種草莓的差異顯著(P<0.05)，從玻璃化程度上看美香莎的最嚴(yán)重，為21.23%；這說明在R1培養(yǎng)基上，紅顏草莓無菌苗的再生頻率及每葉片平均再生芽數(shù)都是最好。在R2培養(yǎng)基上4種草莓再生頻率不同，最高的是紅顏草莓，再生頻率為80.40%，與其他3種草莓的差異顯著(P<0.05)，紅顏草莓每葉片平均再生芽數(shù)也最多，為3.65個(gè)，與其他3種草莓的差異顯著(P<0.05)，從玻璃化程度上看美香莎的最嚴(yán)重，為16.73%；這說明在R2培養(yǎng)基上，紅顏草莓無菌苗的再生頻率及每葉片平均再生芽數(shù)都是最好。

而同一品種繼代材料葉片在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化效果不同。由表2還可知，紅顏草莓在R2上的再生頻率為80.40%，高于R1上的再生頻率(74.53%)，每葉片平均再生芽數(shù)R2上的為3.65也高于R1上的再生芽數(shù)(2.98)；哈尼草莓在R2上的再生頻率為75.14%，高于R1上的再生頻率(71.33%)，每葉片平均再生芽數(shù)R2上的為3.29也高于R1上的再生芽數(shù)(2.43)；章姬草莓在R2上的再生頻率為61.13%，高于R1上的再生頻率(56.13%)，每葉片平均再生芽數(shù)R2上的為2.83，也高于R1上的再生芽數(shù)(2.28)；美香莎草莓在R2上的再生頻率為57.12%，高于R1上的再生頻率(54.07%)，每葉片平均再生芽數(shù)R2上的為2.75，也高于R1上的再生芽數(shù)(2.09)。說明R2培養(yǎng)基較適宜草莓葉片的再生分化。

表2 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)4個(gè)草莓品種葉片不定芽的生長(zhǎng)

2.2.2 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)4個(gè)草莓品種葉柄不定芽的生長(zhǎng) 由表3可知，4種不同品種繼代材料葉柄在同一培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生分化不同，紅顏草莓再生頻率最高，為23.39%，哈尼草莓的為18.88%，與紅顏草莓的差異不顯著(P>0.05)美香莎的再生頻率最低，為15.59%，與紅顏草莓的差異顯著(P<0.05)；紅顏草莓每葉柄平均再生芽數(shù)也最多，為2.61個(gè)，與其他3種草莓的差異不顯著(P>0.05)，哈尼草莓再生芽數(shù)為2.53個(gè)，章姬草莓的再生芽數(shù)為2.42個(gè)，美香莎草莓的再生芽數(shù)為2.31個(gè)；從玻璃化程度上看美香莎的最嚴(yán)重，為28.59%。這說明在R1培養(yǎng)基上，紅顏草莓無菌苗的再生頻率及每葉柄平均再生芽數(shù)都是較好。在R2培養(yǎng)基上4種草莓再生頻率不同，最高的是紅顏草莓，再生頻率為26.75%，與其他3種草莓的差異顯著(P<0.05)；紅顏草莓每葉片平均再生芽數(shù)也最多，為3.12個(gè)，與其他3種草莓的差異顯著(P<0.05)；從玻璃化程度上看美香莎的最嚴(yán)重，為22.37%。這說明在R2培養(yǎng)基上，紅顏草莓無菌苗的再生頻率及每葉柄平均再生芽數(shù)都較好。

同一品種繼代材料葉柄在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化效果不同。由表3還可知，紅顏草莓在R2上的再生頻率為26.75%，高于R1上的再生頻率(23.39%)，每葉柄平均再生芽數(shù)R2上的為3.12，也高于R1上的再生芽數(shù)(2.61)；哈尼草莓在R2上的再生頻率為22.37%，高于R1上的再生頻率(18.88%)，每葉柄平均再生芽數(shù)R2上的為2.87，也高于R1上的再生芽數(shù)(2.53)；章姬草莓在R2上的再生頻率為17.95%，高于R1上的再生頻率(15.97%)，每葉片平均再生芽數(shù)R2上的為2.51，也高于R1上的再生芽數(shù)(2.42)；美香莎草莓在R2上的再生頻率為57.12%，高于R1上的再生頻率(54.07%)，每葉片平均再生芽數(shù)R2上的為2.4，也高于R1上的再生芽數(shù)(2.31)。說明R2培養(yǎng)基比R1培養(yǎng)基較適宜草莓葉柄的再生分化。

表3 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)4個(gè)草莓品種葉片不定芽的生長(zhǎng)

由表2和表3對(duì)比可以看出，在同一培養(yǎng)基上誘導(dǎo)同一品種的不同繼代材料，再生率不同，對(duì)比R2培養(yǎng)基上葉片和葉柄的分化誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)：紅顏草莓葉片再生頻率高出葉柄再生頻率53.65%，葉片再生芽數(shù)高出葉柄0.53；哈尼草莓葉片再生頻率高出葉柄再生頻率52.77%，葉片再生芽數(shù)高出葉柄0.42；章姬草莓葉片再生頻率高出葉柄再生頻率43.18%，葉片再生芽數(shù)高出葉柄0.32；美香莎草莓葉片再生頻率高出葉柄再生頻率41.94%，葉片再生芽數(shù)高出葉柄0.28。4種草莓葉片再生分化過程中玻璃化程度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于葉柄，說明利用草莓無菌苗葉片更易獲得再生苗(圖1、圖2)。

注：A：紅顏葉片再生分化；B：紅顏葉柄再生分化。

圖1R1培養(yǎng)基誘導(dǎo)再生分化

Fig.1 Regeneration on R1 medium

注：C：紅顏葉片再生分化；D：紅顏葉柄再生分化。

圖2R2培養(yǎng)基誘導(dǎo)再生分化

Fig.2 Regeneration on R2 medium

3 結(jié)論與討論

我國(guó)雖然是草莓野生種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家，但大果型栽培草莓品種均是由國(guó)外引進(jìn)，引進(jìn)的資源逐漸被利用進(jìn)行資源創(chuàng)新及特性研究，離體培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用于草莓種質(zhì)資源的保存、快繁、再生及脫毒等[4-6]。鄧群仙[13]等研究認(rèn)為在相同條件下，鬼怒甘品種的莖尖生長(zhǎng)速度明顯快于豐香品種，長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于豐香品種，但其叢生芽發(fā)生率低于后者。這與侯喜林等報(bào)道品種對(duì)離體培養(yǎng)中材料生長(zhǎng)、分化等的影響一致。張東輝[14]研究呼和浩特市4種主栽草莓快繁時(shí)，增殖及移栽成活率高低依次是紅顏，章姬，點(diǎn)雪，隨珠草窗。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)增殖倍數(shù)及生根數(shù)最多的也是紅顏。不同草莓品種的組織、器官如葉片、葉柄、花藥、莖等都可以用來作為外植體，得到再生植株，目前研究多以花藥、葉片、匍匐莖為外植體?；ㄋ幈阌诘玫蕉啾扼w植株；葉片可誘導(dǎo)形成愈傷組織，但是植株葉片的苗齡不同、采集時(shí)間不同，再生能力也有差異[9-12,15-16]。董良早[3]研究認(rèn)為再生力為30 d苗>匍匐莖繁殖的當(dāng)年苗>1年苗。本試驗(yàn)主要是采用1.5～2 cm株高的無菌苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。在增殖培養(yǎng)時(shí)，大量研究都是以MS為基本培養(yǎng)基。李曉亮[17]等以草莓莖尖為培養(yǎng)材料，MS為基本培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在草莓莖尖組織培養(yǎng)過程中，草莓的分化、增殖、生根和生長(zhǎng)發(fā)育受到不同因素的影響，效果差異比較大；王建湘[18]以MS為基本培養(yǎng)基，建立了草莓葉片的再生體系。本試驗(yàn)是在前期大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L IBA+6 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)增殖倍數(shù)最高達(dá)7.767，生根數(shù)達(dá)11.100個(gè)，隨著繼代天數(shù)的增加，增殖倍數(shù)增加。而且培養(yǎng)過程中多數(shù)品種不易產(chǎn)生愈傷組織，伸展的葉片正常，紅顏葉大而平展，綠色，葉厚。

利用無菌苗進(jìn)行再生誘導(dǎo)時(shí)，利用其不同植株不同部位進(jìn)行誘導(dǎo)效果不同[12,16]。牛紅云[19]等采用草莓的幼嫩莖段為接種材料，研究發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)出愈傷組織，說明利用草莓的幼嫩莖段可以作為再生材料進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。向云發(fā)[20]等利用晶瑤草莓幼嫩葉柄為外植體，也誘導(dǎo)出愈傷組織，并再生分化出芽，說明可以利用葉柄建立草莓的離體再生體系。王建湘[18]借助離體培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)草莓葉片開展了大量的再生技術(shù)研究，認(rèn)為葉片比較適宜不定芽的誘導(dǎo)。本試驗(yàn)通過誘導(dǎo)4個(gè)品種葉片和葉柄的再生分化發(fā)現(xiàn)，葉片再生率最高的達(dá)到80.40%，高于葉柄誘導(dǎo)率53.65%。

不同草莓品種離體增殖培養(yǎng)的不同階段，利用的激素種類和水平也不同，其離體培養(yǎng)和再生使用較多的激素有6-BA、2,4-D、NAA、IBA、KT、TDZ等。大量研究表明，隨著激素濃度的變化，新芽誘導(dǎo)率、根誘導(dǎo)率、株高、成苗率、增殖倍數(shù)及不定芽誘導(dǎo)率等不同[21]。和秀云[22]等研究托特母草莓不定芽誘導(dǎo)過程中激素水平為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，增殖階段激素水平為6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L，以KT為細(xì)胞分裂素的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用KT容易出現(xiàn)愈傷組織，但后期難以分化成叢芽。袁惠燕[23]等對(duì)6種草莓進(jìn)行研究得出，TDZ在濃度為1.0 mg/L時(shí)，與NAA組合適合于草莓愈傷組織分化。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)適宜的再生分化的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L BA+0.1 mg/L 2.4-D+6 g/L 瓊脂+30 g/L蔗糖，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)另外一種培養(yǎng)基上玻璃化率較高，可能與激素配比有一定的關(guān)系，而且導(dǎo)致不定芽密集叢生、不易分離、芽成苗困難。周書利[24]研究發(fā)現(xiàn)草莓組培過程中，玻璃化苗的出現(xiàn)與組織培養(yǎng)過程中使用的封口膜、瓊脂濃度及碳源相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，與激素如6-BA及其濃度等無關(guān)。張敏[25]研究認(rèn)為草莓組培過程中，組培苗的玻璃化程度與封口膜的透氣性成反比；也受到瓊脂用量的影響，當(dāng)瓊脂濃度為6 g/L時(shí)，組培苗的玻璃化程度較低；蔗糖也有利于玻璃化程度的降低。本研究認(rèn)為，草莓玻璃化受到激素的影響，離體培養(yǎng)草莓容易產(chǎn)生玻璃化，具體機(jī)理和培養(yǎng)時(shí)的防止措施需要進(jìn)一步開展相關(guān)的研究[26]。

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