光質(zhì)對桔梗根生長及有效成分積累的影響

吳 珍，潘婷婷，王新軍

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

桔梗[Platycodongrandiflorus(Jacq).A.DC.]為桔?？浦参?，是一種藥、食、賞兼用植物[1]。常以根入藥，含桔梗皂苷、多糖等多種活性成分，具有多種藥理活性[2]。桔梗皂苷中含量較高的是桔梗皂苷D[3]，屬五環(huán)三萜類皂苷[4]，萜類化合物的合成是由甲羥戊酸途徑或甲基赤蘚醇磷酸途徑合成[5]，三萜皂苷是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，既可增強(qiáng)植物自身抗病、蟲害能力[6]，也是很多中藥材藥用有效成分的重要組分。桔梗含銅、鐵、鋅、錳等22種微量元素，微量元素的量和比例不僅影響桔梗的藥效，也會相互影響或直接參與作用[7]， 如Zn、Cu是人體必需的微量元素，是SOD等多種酶的輔基，可通過體內(nèi)的酶系統(tǒng)間接發(fā)揮對機(jī)體代謝功能的協(xié)調(diào)和抑制，提高機(jī)體的免疫功能，不同中藥材種植在不同環(huán)境下其體內(nèi)Cu/Zn比值不同，藥效也產(chǎn)生差異。

桔梗與其他中藥材一樣，其有效成分皂苷也是次生代謝產(chǎn)物，是植物在長期演化過程中與環(huán)境(生物的和非生物的)相互作用的結(jié)果，外界環(huán)境能影響次生代謝產(chǎn)物的積累[8]。光是植物生命活動的重要環(huán)境因子之一，桔梗等中藥材生長于自然環(huán)境時，周圍高大的林木的遮蔽不僅改變了林下光照強(qiáng)度[9]，也改變了林下的光質(zhì)，而光質(zhì)是不同波長的光譜，作為外界信號通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響著植物內(nèi)部的生理生化變化，從而間接地對植物的形態(tài)建成、生理代謝、光周期反應(yīng)、生長發(fā)育及藥用植物有效成分的含量起重要的調(diào)節(jié)作用[10]。光質(zhì)對植物的次生代謝過程的影響及對有效成分的影響則因植物種類不同而有所差異，如黃光處理下三七單株總皂苷產(chǎn)量最高，有助于促進(jìn)黃芪的干物質(zhì)積累和有效成分的積累；紅光能夠提高根中差向紫杉醇的含量，黃光能顯著提高根中紫杉醇及差向紫杉醇的含量，藍(lán)光能顯著提高根中紫杉醇的含量；紅光+藍(lán)光處理下，丹參中丹酚酸B含量顯著提高；白光更有利于三七有效成分的積累，黃光處理下三七單株總皂苷產(chǎn)量最高[11-13]，光質(zhì)也影響黃酮類、花色素等合成[14]，目前有關(guān)光質(zhì)對桔梗生長及皂苷和多糖影響的研究鮮見報道。

本研究以2年生桔梗植株為試驗(yàn)材料，測定了在不同光質(zhì)(紅、黃、綠、紫、藍(lán))處理下的部分生長指標(biāo)及產(chǎn)量、皂苷含量、多糖含量、Cu、Zn的含量及Cu/Zn比值，同時對產(chǎn)生差異的原因進(jìn)行分析，探索皂苷、多糖等有效成分在桔梗體內(nèi)累積的規(guī)律，對桔梗栽培環(huán)境的選擇和栽培管理措施的選用具有指導(dǎo)意義，同時也可為中藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桔梗來自商洛學(xué)院試驗(yàn)地栽植的2年生桔梗。

試驗(yàn)用紫、紅、黃、綠和藍(lán)色濾膜(遮光膜購于廣州市樂迪燈光設(shè)備廠生產(chǎn)的光學(xué)色紙)模擬不同光質(zhì)的光，將各色濾膜覆蓋在用直徑0.6 cm鋼筋做成的支架(70 cm×120 cm×80 cm)上，膜各邊下端距地面20 cm，頂端兩邊不封口并用直徑2.0 cm的竹棍支開，這樣有利于膜內(nèi)空氣流通和防止膜內(nèi)側(cè)凝結(jié)水珠。將每個處理設(shè)3個平行置于不同光質(zhì)的膜下并隨機(jī)排列。

1.2 材料處理

將2年生桔梗在不同濾膜下生長3個月后，在秋季將不同光質(zhì)下新鮮桔梗根采收，洗凈，刮去外皮，切片，一半置于80℃烘箱中殺青20 min，然后置于60℃烘箱中烘至恒重[15]，粉碎過60目篩，為測定桔梗多糖含量備用；另一半直接置于80℃烘箱中烘至恒重，粉碎過60目篩，備用。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 桔梗根生長性狀及鮮重測定 測定新鮮桔梗根部性狀指標(biāo)[16]：主根粗(cm)：用游標(biāo)卡尺測量主根最大直徑處；主根長(cm)：用直尺測量主根從蘆頭到根尖(直徑0.1 cm處)之間的長度；側(cè)根數(shù)(個)：測定從主根上發(fā)出的直徑達(dá)到0.1 cm以上的側(cè)根個數(shù)；單根鮮重(g)：除去泥土，放在電子天平上稱根部鮮重。每處理采樣3株，進(jìn)行各指標(biāo)測定。

數(shù)據(jù)用Excel 2007處理，用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行方差分析。

1.3.2 桔梗多糖、皂苷及Cu、Zn含量測定

1.3.2.1 皂苷的提取及含量測定 1)皂苷提?。杭状汲曁崛》╗17]

精確稱取桔梗干粉1.00 g，過60目篩，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL溶解，超聲提取，溫度45℃，時間30 min，重復(fù)3次，提取結(jié)束后放置至室溫，抽濾，得濾液，濃縮，加15 mL乙醚萃取2次，棄去醚層，水層加入15 mL、10 mL正丁醇萃取2次，合并正丁醇液，減壓回收得到沉淀物，稱取質(zhì)量，取5 mg用甲醇定容至50 mL備用。

2)皂苷含量測定：用桔梗皂苷標(biāo)準(zhǔn)品精確制備1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按表1中的標(biāo)準(zhǔn)系列制備梯度溶液，依據(jù)香草醛-硫酸比色法操作步驟測定472 nm吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行各樣品皂苷含量測定。

1.3.2.2 多糖的提取及含量測定 1)多糖提?。撼暡ㄝo助水提法[18]

精確稱取桔梗干粉1.00 g，過60目篩，按料液比1∶30加入溶劑，放置一段時間，采用60℃超聲波處理1 h，放置至室溫，抽濾，得濾液，減壓濃縮，加入3倍體積的無水乙醇出現(xiàn)絮狀物，放在4℃冰箱中，靜置24 h，倒掉上清液，抽濾，將濾紙烘干，準(zhǔn)確稱取樣品溶解于蒸餾水中，并定容至濃度在200 μg/mL，備用。

2)多糖含量測定：配制1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再按表1中的標(biāo)準(zhǔn)系列制備梯度溶液，用硫酸-苯酚比色法測定標(biāo)準(zhǔn)490 nm吸光度。樣品含量測定條件與做標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。

1.3.2.3 Cu、Zn含量的測定[19]稱取適量干桔梗根，置于三角瓶，加入5 mL濃硝酸，用封口膜封口靜置過夜。第2天用小火加熱直至無NO2氣體產(chǎn)生，自然冷卻，加入3 mL濃硫酸及5 mL濃硝酸后繼續(xù)消化直至冒白煙，自然冷卻后，加入5 mL HNO3及2 mL高氯酸(HClO4)，繼續(xù)消化到白煙冒完，自然冷卻后測量取其體積，搖勻，備用，在樣品消化同時還應(yīng)做空白消化液一份。分別制備50 μg/mL的Cu銅標(biāo)準(zhǔn)溶液及Zn標(biāo)準(zhǔn)溶液，用火焰原子吸收分光光度計制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行樣品測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列

桔梗皂苷、多糖、Cu、Zn標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按表1、表2系列進(jìn)行。

表1 皂苷、多糖標(biāo)準(zhǔn)系列及測定的波長

表2 微量元素標(biāo)準(zhǔn)系列及測定波長

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)處理對桔梗根生長性狀影響

由表3可以看出，不同濾膜處理對桔梗生長及產(chǎn)量有不同影響，紅膜處理下桔梗的主根鮮重、主根粗和側(cè)根數(shù)均最高，綠膜處明顯促進(jìn)了桔梗主根的伸長，與對照組(太陽光)相比，紅膜處理下桔梗主根鮮重、主根粗和側(cè)根數(shù)分別提高了26.92%、22.48%、45.71%，藍(lán)膜處理顯著降低了桔梗的重量和主根直徑，藍(lán)膜下桔梗的側(cè)根數(shù)也明顯減少，紫、黃、綠膜對桔梗根的性狀也有影響，黃膜下桔梗的主根鮮重顯著降低，側(cè)根數(shù)顯著增多。

表3 不同光質(zhì)下桔梗的根長、側(cè)根數(shù)及鮮重

注：CK:對照、B：藍(lán)光、V：紫光、Y：黃光、G：綠光、R：紅光；表內(nèi)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5進(jìn)行方差分析,*表示差異顯著(P≤0.05)，**表示極顯著(P≤0.01)。表4、表5同。

2.2 不同光質(zhì)處理對桔梗皂苷和多糖含量的影響

由表4可知，不同濾膜處理對桔梗根中皂苷含量影響不同，大小依次為紅>對照>綠>黃>藍(lán)>紫，紅膜處理下桔梗皂苷含量提高了3.27%，但未達(dá)顯著水平，藍(lán)膜與紫膜處理下桔梗皂苷含量顯著降低，皂苷的含量分別降低了25.59%、32.14%，黃膜和綠膜處理對桔梗皂苷含量無顯著影響。

由表4可知，在不同光質(zhì)下處理對桔梗的多糖含量均有影響，多糖含量依次為藍(lán)>紅>綠>對照>紫>黃，與對照組相比，藍(lán)、紅和綠膜處理組的桔梗多糖含量均顯著高于對照組，桔梗多糖含量分別高了36.82%、33.21%、18.28%，黃膜處理下桔梗多糖含量顯著降低21.04%，紫膜對桔梗多糖含量無明顯影響。

2.3 不同光質(zhì)處理對桔梗Cu、Zn含量及Cu/Zn比值的影響

由表5可知，在不同光質(zhì)處理均顯著提高了桔梗中Cu含量，Cu含量由高到低依次為紫>黃>紅> 藍(lán) >綠>對照，與對照組相比，Cu含量分別提高了28.13%、27.74%、24.48%、20.49%、5.63%；而光質(zhì)處理對桔梗中Zn含量的也有顯著影響，Zn含量由高到低依次為紫>紅>藍(lán)>對照>黃，除黃膜處理組中Zn含量降低了2.32%外，其余處理組中Zn含量均明顯高于對照組，Zn含量分別高于對照組47.09、36.91%、31.83%、18.11%；藍(lán)膜處理對桔梗的Cu/Zn比值明顯影響，黃膜處理顯著提高Cu/Zn比值，綠膜、紫膜明顯降低了Cu/Zn比值，紅膜也可降低Cu/Zn比值，Cu/Zn比值由低到高依次是綠<紫<紅<對照<藍(lán)<黃。

表4 不同光質(zhì)處理下桔梗根中皂苷和多糖含量

3 結(jié)論與討論

本研究利用不同顏色濾膜模擬林下不同光質(zhì)對桔梗進(jìn)行處理，研究了光質(zhì)對桔梗生長、經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量、桔梗皂苷、桔梗多糖、Cu、Zn含量及Cu/Zn比值均有不同程度的影響。研究表明，紅膜對桔梗根系的生長有顯著的促進(jìn)作用，藍(lán)膜對桔梗根系的生長顯著的抑制作用，紅膜能促進(jìn)糖代謝作用[20]，更有利于可溶性糖和多糖的積累，從而促進(jìn)了根系及桔梗的營養(yǎng)生長，這與多數(shù)研究者的紅光促進(jìn)營養(yǎng)生長的研究結(jié)果相近。

表5 不同光質(zhì)處理下桔梗的Cu和Zn含量

通過本研究可知，與對照(太陽光)相比，藍(lán)、紫膜能顯著降低桔梗皂苷含量，黃膜和綠膜兩種處理作用均不顯著，這與李馨蕓[21]在絞股藍(lán)研究的結(jié)果相似，可能由于自然光包含了紅光等單色光，桔梗皂苷的合成中調(diào)控位點(diǎn)不止一個，而影響皂苷合成的關(guān)鍵酶生理活性的環(huán)境因素也很多[22]。本研究中藍(lán)、紅和綠膜處理均顯著提高桔梗多糖含量，黃膜處理顯著降低了桔梗多糖含量，紫膜對桔梗多糖含量無顯著影響。光質(zhì)影響桔梗多糖含量的原因使多方面的，可能是由于不同光質(zhì)影響著糖類物質(zhì)的運(yùn)輸和積累，從而改變了根部可溶性糖的含量，也可能是光質(zhì)的變化誘導(dǎo)了光敏色素對蔗糖代謝的酶的調(diào)控，促進(jìn)與糖代謝相關(guān)的酶活性的提高，使更多的光合作用產(chǎn)物積累在桔梗根部。

不同光質(zhì)對桔梗皂苷和桔梗多糖含量的影響也反映了植物的初生代謝和次生代謝的相互關(guān)系，桔梗皂苷合成是建立在初生代謝基礎(chǔ)上的次生代謝，其產(chǎn)物種類與數(shù)量多少與初生代謝有直接聯(lián)系。本研究中所顯示的藍(lán)光處理下桔梗多糖顯著增加，而桔梗皂苷含量顯著降低也正反映了皂苷的合成是建立在糖代謝等初生代謝基礎(chǔ)上的次生代謝。通過藍(lán)光處理可能抑制了皂苷合成的某些關(guān)鍵酶活性[23]，也可能是藍(lán)光能促進(jìn)光合產(chǎn)物磷酸丙糖轉(zhuǎn)化為蔗糖并進(jìn)一步合成多糖，因而呈現(xiàn)出在藍(lán)膜下桔梗多糖含量增高但是桔梗皂苷相對含量減少的現(xiàn)象。紫膜及黃膜處理下桔梗的生長、產(chǎn)量及有效成分的含量均比對照降低。

本研究還表明，除黃膜外，不同光質(zhì)均能顯著提高桔梗中的Cu、Zn 2種微量元素的含量，而且綠、紫、紅膜能顯著提高Zn含量，并顯著降低了Cu/Zn比值，而黃光處理則顯著提高了Cu/Zn比值，在桔梗生長后期，營養(yǎng)生長變慢，可用綠膜處理，以增加體內(nèi)Zn含量，降低Cu/Zn比值。

根據(jù)其他研究者總結(jié)的桔梗生長的動態(tài)變化規(guī)律[17]，結(jié)合本研究的結(jié)果，在桔梗生長的前期至中期可先用紅膜處理，在后期用藍(lán)膜或綠膜處理，既能提高鮮重及外觀品質(zhì)，又能促進(jìn)其有效成分含量的增加藥效。

光質(zhì)只是影響桔梗生長和有效成分積累的重要的環(huán)境因子之一，光強(qiáng)度、光照時間、溫度、水分、土壤肥力等也是桔梗生長及質(zhì)量提高和道地性形成的關(guān)鍵因素，并且各環(huán)境因子之間也會相互作用或者通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互交叉影響桔梗的次生代謝，促進(jìn)藥材品質(zhì)的提高，因此協(xié)調(diào)運(yùn)用各種環(huán)境條件，才能建立適于桔梗規(guī)范化生產(chǎn)的栽培模式。

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