6種葡萄風(fēng)信子倍性鑒定

孔令月，李冬梅，劉雅莉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

葡萄風(fēng)信子是一種以藍(lán)色著稱的香花植物，為天門冬科葡萄風(fēng)信子屬(Muscari)，是一種原產(chǎn)于東地中海的希臘、土耳其至高加索地區(qū)多年生球根花卉，并且其抗寒、抗旱性和復(fù)花性良好[1-3]，被廣泛應(yīng)用于地被，花境、草坪鑲邊，或家庭盆栽。

自然界中的多倍體植物極為常見，大部分被子植物都經(jīng)歷了多倍化事件[4]，這使基因出現(xiàn)多樣化突變，除繼承原本功能外，還可能出現(xiàn)功能的喪失、分化，甚至進(jìn)化出新的功能?；驈?fù)制和隨后的基因功能差異促進(jìn)植物的適應(yīng)性進(jìn)化[5]。因此，植物倍性對(duì)研究植物基因功能、遺傳育種等方面都具有巨大指導(dǎo)意義。

關(guān)于葡萄風(fēng)信子倍性的研究在1968年就已出現(xiàn)，早期大部分研究表明，葡萄風(fēng)信子屬的染色體基本數(shù)目是x=9[6-8]。Johnson等通過標(biāo)準(zhǔn)根尖壓片法方法調(diào)查多個(gè)土耳其地區(qū)葡萄風(fēng)信子樣本發(fā)現(xiàn)，M.neglectum染色體數(shù)目有2n=18,36,54，M.armeniacum2n=18,18+2B,36;M.aucheri2n=18,36[8-10]。另有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)M.neglectum八倍體外觀正常，與鄰近的四倍體、六倍體大小并無顯著差異[11]。葡萄風(fēng)信子某些品種的染色體數(shù)目至今存在爭(zhēng)議，這就為后期研究基因功能、雜交育種造成了極大的困難。

本試驗(yàn)以葡萄風(fēng)信子亞美尼亞、蔚藍(lán)、‘海洋的魔法’、‘黑眼睛’、‘白色麗人’、‘日出’為材料，利用流式細(xì)胞儀對(duì)6種葡萄風(fēng)信子進(jìn)行倍性分析，為后期葡萄風(fēng)信子的品種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為葡萄風(fēng)信子亞美尼亞M.armeniacum，‘海洋的魔法’M.aucheri‘Ocean Magic’，‘黑眼睛’M.armeniacum‘Dark Eyes’，葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)M.azureum，‘白色麗人’M.aucheri‘White beauty’和‘日出’M.‘Pink Surprise’。所有種球購于浙江虹越花卉股份有限公司并種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田(34°14′53.27″N，108°03′10.85″E)。第2年種球萌發(fā)后取新鮮根尖和葉片用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)壓片法鑒定葡萄風(fēng)信子倍性 隨機(jī)選取6株葡萄風(fēng)信子‘蔚藍(lán)’，通過常規(guī)壓片法進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。參考戴小紅[12]等百合根尖處理方法，在溫暖的晴天取分裂旺盛的根尖材料，以0.002 M的8-羥基喹啉溶液室溫(20±4)℃下處理3～5 h，蒸餾水沖洗2次后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(V無水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)中固定6 h，用95%酒精洗去冰醋酸，最后將材料保存于70%酒精中。制片時(shí)將固定后的材料取出，用60℃預(yù)熱的1 mol/L鹽酸解離8～10 min，改良卡寶品紅溶液染色5 min，壓片法制片，OLYMPUS BX51研究級(jí)正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分析倍性 參照J(rèn)aroslav Dolezel[13]等的方法，在培養(yǎng)皿中加1 mL預(yù)冷的Tris.MgCl2buffer(200 mmol·L-1Tris,4 mmol·L-1MgCl2·6H2O,0.5% (v/v) TritonX-100用1 N HCl調(diào)節(jié)pH值至7.5)，取待測(cè)葡萄風(fēng)信子新鮮葉片約50 mg放入培養(yǎng)皿，以鋒利刀片迅速切碎，晃動(dòng)幾下混合均勻，用42 μm尼龍網(wǎng)過濾液體，最后同時(shí)加入Propidium Iodide (PI) 染料(50 μg/mL)和RNase (50 μg/mL)，冰上孵育30 min。樣品使用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。用FlowJo VX軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)壓片法鑒定葡萄風(fēng)信子倍性

對(duì)葡萄風(fēng)信子進(jìn)行壓片分析，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)可以觀察到成對(duì)的細(xì)胞分裂中期染色體，為二倍體，2n=2x=18(圖1)。

注：A：葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)分裂中期染色體；B：葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)核型。

圖1葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)中期染色體及核型

Fig.1 The metaphase chromosome and chromosome karyotype ofM.azureum

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)葡萄風(fēng)信子倍性

后續(xù)以二倍體葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)為外標(biāo)，利用流式細(xì)胞儀對(duì)5種葡萄風(fēng)信子倍性進(jìn)行鑒定，根據(jù)G1時(shí)期峰平均熒光強(qiáng)度計(jì)算可知相對(duì)DNA含量(圖2)。結(jié)果顯示，除蔚藍(lán)外，還有‘黑眼睛’、‘日出’為二倍體，‘白色麗人’、‘海洋的魔法’為三倍體，葡萄風(fēng)信子亞美尼亞為四倍體。

3 結(jié)論與討論

本研究首次鑒定了葡萄風(fēng)信子蔚藍(lán)、‘黑眼睛’、‘日出’、‘白色麗人’和‘海洋的魔法’的倍性。傳統(tǒng)根尖壓片法分析植物核型工作量大、耗費(fèi)時(shí)間長[14]，前期鏡檢6種葡萄風(fēng)信子根尖，很難得到清晰可分離的染色體分裂中期細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于研究生物進(jìn)化、分類來說，研究多采用核型分析[15-16]，但對(duì)于僅分析染色體數(shù)目，采用已知倍性的材料做參照，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)更方便快捷。由于目前尚未出現(xiàn)植物通用的細(xì)胞核緩沖液，檢測(cè)不同植物或者不同組織只能通過試驗(yàn)選擇合適的試劑，植物組織中的多糖、多酚或其他代謝產(chǎn)物都會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生影響[17-18]，而葡萄風(fēng)信子是一種富含多糖的植物[19]，流式細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示有部分細(xì)胞的熒光強(qiáng)度結(jié)果出現(xiàn)在坐標(biāo)軸以外，可能是多糖物質(zhì)影響了緩沖液，切割不完全，使多個(gè)細(xì)胞粘連所致。

倍性不明確一直是葡萄風(fēng)信子育種中的重要障礙。對(duì)于葡萄風(fēng)信子屬植物來說，種內(nèi)倍性變化并不罕見，特別是M.armeniacum和M.neglectum。早期Stuart[18]研究發(fā)現(xiàn)二者染色體數(shù)均為2n=18。而Dalgic[9]認(rèn)為M.neglectum不同個(gè)體可能是2n=28,45,54。T.KARLEN[11]研究了M.neglectum希臘地區(qū)81個(gè)種群，其中32個(gè)為2n=18，22個(gè)2n=36，22個(gè)2n=54，1個(gè)2n=72，并且八倍體植株外觀正常，大小也與四倍體和六倍體并無差別。Johnson[10]對(duì)土耳其地區(qū)的葡萄風(fēng)信子屬野生種群核型分析發(fā)現(xiàn)，M.armeniacum有2n=18，18+2B，18+0-3B，36，M.neglectum也出現(xiàn)2n=18，36。A.Jafari[20]等對(duì)M.neglectum研究發(fā)現(xiàn)，采自伊朗東南的M.neglectum樣本，還有2x=2n-1=54，2x=2n+3=48等情況出現(xiàn)。

注：A：蔚藍(lán)；B：‘黑眼睛’；C：‘日出’；D：‘白色麗人’；E：‘海洋的魔法’；F ：亞美尼亞。

但對(duì)比葡萄風(fēng)信子屬上述2個(gè)品種，M.botryoides的倍性分布似乎有一定地域規(guī)律。Lajos Somlyay 等人對(duì)從匈牙利(25個(gè)地區(qū))和羅馬尼亞(1個(gè)地區(qū))采集的葡萄風(fēng)信子樣本進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)羅馬尼亞采集的樣本(M.transsilvanicum)為二倍體(2n=18)，匈牙利地區(qū)的樣本(M.botryoides)二倍體和四倍體均有出現(xiàn)，所有二倍體樣本均具有相似核型，且從核型觀察，四倍體似乎就是二倍體的加倍。從地理分布上看，匈牙利地區(qū)二倍體和四倍體分別占據(jù)著非重疊區(qū)域，二倍體種群幾乎完全被限制于大陸性氣候較強(qiáng)的潘諾尼亞區(qū)域，而四倍體出現(xiàn)在另一側(cè)，M.transsilvanicum和M.botryoides物種水平的生殖障礙僅是由于不同倍性水平和分布引起的，之前多個(gè)報(bào)道中的M.transsilvanicum和M.botryoides，并不能被證明是2個(gè)種[21]。

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