長鏈非編碼RNA HOXA11-AS表達(dá)對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和患者預(yù)后的影響

張 莉，伍 靖，李曉宇

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518109)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類含200～100 000個(gè)核苷酸，無或很少編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，其在轉(zhuǎn)錄沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾等多個(gè)方面參與基因的表達(dá)調(diào)控[1-2]。起初，lncRNA一直被認(rèn)為是基因組的“暗物質(zhì)”，不具有生物學(xué)功能。但是，隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到lncRNA參與了包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[3-5]。深入研究lncRNA的表達(dá)、功能和分子機(jī)制，對于理解腫瘤等復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找更加合適的診斷和治療靶點(diǎn)具有重要意義。同源異型盒11反義RNA (homeobox A11 antisense RNA，HOXA11-AS)是一個(gè)定位在HOXA11基因反義DNA鏈上的lncRNA，轉(zhuǎn)錄本長度為5.1 kb[6]。近年來，已有多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，HOXA11-AS在包括胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等腫瘤中差異表達(dá)，可以作為這幾種腫瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[7-9]。但是，截止目前，HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其作用尚無報(bào)道。本研究通過Gene Expression Profiling Interactive Analyses(GEPIA)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)挖掘，并檢測HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，來探究其對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的影響，以闡明HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)程中的作用。

1 資料與方法

1.1組織標(biāo)本及細(xì)胞系收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院口腔頜面外科2016年10月至2017年3月手術(shù)切除的24例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁0.5 cm外正常組織(癌旁組織)標(biāo)本，其中男17例，女7例；年齡26～61(45.83±8.90)歲；舌癌14例，頰癌10例。所有病例經(jīng)病理科確診為鱗狀細(xì)胞癌，并取得患者的知情同意，患者手術(shù)前均未接受過放射治療和化學(xué)治療。人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研中心饋贈。

1.3方法

1.3.1GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)挖掘首先，在GEPIA[10]數(shù)據(jù)庫中選擇來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的所有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及正常組織的RNA測序數(shù)據(jù)，以“HOXA11-AS”為檢索詞，以P<0.01為具有顯著性差異，分析其是否存在差異表達(dá)。然后以HOXA11-AS的表達(dá)從高到低進(jìn)行排序，前25%的樣本為高表達(dá)樣本，后25%的樣本為低表達(dá)樣本，分析其表達(dá)與患者總體生存率和無病生存率的關(guān)系。

1.3.2HOXA11-AS表達(dá)的檢測按照TRIzol試劑說明書上的步驟分別提取頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織或者頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113的總RNA。將提取完成的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性后，測定總RNA濃度。然后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測HOXA11-AS的表達(dá)(根據(jù)反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行)，以β-Actin為內(nèi)參，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.3細(xì)胞接種、轉(zhuǎn)染及分組取頭頸部鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞接種于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取處于對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞生長至 60%～70%融合時(shí)，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加HOXA11-AS siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(按照Hiperfect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行)，對照組加陰性對照siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后將細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后采用qRT-PCR法檢測 2組細(xì)胞中HOXA11-AS的表達(dá)。

1.3.4Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)待Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA達(dá)到24 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，并調(diào)整細(xì)胞濃度至10×107L-1。向Transwell小室下腔室中加入800 μL含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的培養(yǎng)基，上室中加入 200 μL 上述細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，生理鹽水中清洗小室2遍，甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，清水洗滌小室3遍。加入 1 g·L-1結(jié)晶紫室溫染色5 min，再用生理鹽水洗去多余結(jié)晶紫，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，每個(gè)孔拍照5張并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目。

3)在搭建無線網(wǎng)絡(luò)鏈路時(shí)要合理選擇基站位置，避免建造難度過大。對于較長鏈路，要勘查優(yōu)化，繪制鏈路縱斷面圖，分析凈空，確保信號傳輸無遮擋，保障傳輸質(zhì)量。還要結(jié)合周圍環(huán)境考慮，避免與區(qū)域內(nèi)通訊、輸電設(shè)施相互干擾。

2 結(jié)果

2.1HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織(n=519)中的表達(dá)較正常組織(n=44)中顯著增高，是正常組織的1.21倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。HOXA11-AS表達(dá)與患者的總體生存率和無病生存率相關(guān)，風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)分別為1.5和1.6，P值分別為0.043和0.039，見圖2和圖3。

2.2HOXA11-AS在24例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平分別為2.58±0.37、0.95±0.29，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織及正常組織中HOXA11-AS表達(dá)

Fig.1ExpressionofHOXA11-ASinthenormaltissuesandheadandnecksquamouscellcarcinoma

2.3siRNA對HOXA11-AS的沉默效果HOXA11-AS在實(shí)驗(yàn)組和對照組Tca8113細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為0.43±0.05，1.08± 0.07，實(shí)驗(yàn)組Tca8113細(xì)胞中HOXA11-AS表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2HOXA11-AS表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者總體生存率的關(guān)系

Fig.2RelationshipbetweentheexpressionofHOXA11-ASandoverallsurvivalofheadandnecksquamouscellcarcinomapatients

圖3HOXA11-AS表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存率的關(guān)系

Fig.3RelationshipbetweentheexpressionofHOXA11-ASanddiseasefreesurvivalofheadandnecksquamouscellcarcinomapatients

2.4沉默HOXA11-AS表達(dá)對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力的影響對照組和實(shí)驗(yàn)組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目分別為212±15、113±9個(gè)。實(shí)驗(yàn)組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目顯著少于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組。

圖4HOXA11-AS表達(dá)對Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響

Fig.4EffectofHOXA11-ASonTca8113cellsmigrationability

3 討論

lncRNA是一組內(nèi)源性、長度超過200 nt、缺少特異完整的開放閱讀框、無或很少有蛋白編碼功能的RNA分子。其可作為功能蛋白質(zhì)的信號、誘導(dǎo)、誘餌或支架分子等，在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯及翻譯后水平等多層面調(diào)控基因的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[11-12]。在頭頸部腫瘤中以鼻咽癌中的功能性lncRNA報(bào)道較為多見。早在2002年，TAN等[13]發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌相關(guān)lncRNA NAG7能夠影響鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡水平。此后，又有多個(gè)lncRNA被發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中差異表達(dá)且具有重要的生物功能[14-17]。然而，還有大量與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸相關(guān)的lncRNA表達(dá)、功能及分子機(jī)制尚不清楚。

本研究通過對GEPIA數(shù)據(jù)庫的TCGA進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，且其與患者的預(yù)后密切相關(guān)；繼而利用qRT-PCR技術(shù)在24例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中驗(yàn)證了HOXA11-AS的高表達(dá)；最后在利用RNAi技術(shù)干擾了HOXA11-AS的表達(dá)后，檢測了其對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力的影響。本研究首次證實(shí)了HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，沉默HOXA11-AS表達(dá)能夠在體外抑制人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113的遷移能力。這極大地豐富了lncRNA參與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程的機(jī)制。但是，HOXA11-AS影響頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的具體分子機(jī)制以及其在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中是否還具有其他的生物功能，目前尚不十分清楚，還有待深入研究。

綜上所述，HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮著類似致瘤基因的功能，能夠顯著促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移。深入理解其作用機(jī)制，將對未來頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物開發(fā)和治療靶點(diǎn)確證具有較大的意義。

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