拉莫三嗪對癲癇大鼠海馬組織中Caspase-3和熱休克蛋白70表達(dá)的影響

高 靜，石景鶴，王家勤，張迎輝

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院兒科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州兒童醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450053；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院兒童康復(fù)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

癲癇是一種由多種病因引起的、以大腦神經(jīng)元異常同步過度放電而導(dǎo)致的突然、短暫并反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的腦部疾患，是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病之一。全世界癲癇患病率約為8‰，發(fā)展中國家的患病率高于發(fā)達(dá)國家，約60%的癲癇患者于兒童期起病，兒童癲癇患病率高達(dá)0.40%～0.58%[1]，其發(fā)病機制較為復(fù)雜，迄今為止尚未完全闡明。目前，癲癇仍以抗癲癇藥物(antiepileptic drug，AED)治療為主，AED根據(jù)其作用靶標(biāo)可分為影響鈉離子通道的藥物、影響鈣離子通道的藥物以及影響神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)激活的藥物3類。拉莫三嗪是一種新型抗癲癇藥物，其主要是選擇性作用于電壓門控鈉離子通道，抑制病灶內(nèi)神經(jīng)元反復(fù)異常放電，同時抑制谷氨酸的病理性釋放，其作用機制異于其他常用的AED[2]，尤其是對患兒的認(rèn)知功能影響較小[3]。Caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶，是Caspases家族的核心成員，HSP70可維持神經(jīng)元內(nèi)蛋白自穩(wěn)，對神經(jīng)元有保護(hù)作用[4]。拉莫三嗪劑量變化是否會對Caspase-3和熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)水平造成影響，目前尚未見相關(guān)研究證實?；诖耍狙芯繎?yīng)用戊四氮建立癲癇大鼠模型后給予不同濃度的拉莫三嗪進(jìn)行干預(yù)，觀察拉莫三嗪對戊四氮致癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及對Caspase-3和HSP70表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康6周齡雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠100只，體質(zhì)量(180.0±20.0)g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。SD大鼠飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)重點實驗室，于12 h光亮/黑暗、環(huán)境溫度18～25 ℃下分籠喂養(yǎng)，普通飼料，自由進(jìn)食、進(jìn)水，每2 d更換1次墊料。

1.2主要試劑與儀器戊四氮(美國Sigma公司)，拉莫三嗪(波蘭GlaxoSmithKline Pharmaceuticals SA公司，進(jìn)口藥品注冊證號H20140478)，HSP70一抗(bs-0126R)、Caspase-3一抗(bs-0081R)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，SP-9001免疫組織化學(xué)染色試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)辣根過氧化氫酶(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Z-H-9507285顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，切片機(德國LEICA公司)。

1.3方法

1.3.1實驗分組及各組大鼠干預(yù)措施將100只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組和拉莫三嗪低、中、高劑量組，每組20只。模型組及拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠每天腹腔注射戊四氮35 mg·kg-1，并觀察其行為學(xué)變化30 min；正常對照組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。行為學(xué)判斷按Racine分級法[5]：0級：無任何反應(yīng)；Ⅰ級：濕狗樣抖動，面肌痙攣、眨眼、動須、抽搐及節(jié)律性咀嚼；Ⅱ級：頸部肌肉痙攣，點頭和(或)甩尾；Ⅲ級：一側(cè)前肢痙攣；Ⅳ級：雙側(cè)前肢痙攣伴伸直站立；Ⅴ級：全身陣攣甚至失去平衡及摔倒。以連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級及以上發(fā)作作為點燃標(biāo)準(zhǔn)，即癲癇動物模型建立成功。點燃后，正常對照組大鼠繼續(xù)每日腹腔注射生理鹽水；其余4 組大鼠繼續(xù)腹腔注射戊四氮維持點燃，在此基礎(chǔ)上，拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠分別給予拉莫三嗪 20、30、60 mg·kg-1·d-1灌胃，模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，共2周。

1.3.2各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)觀察大鼠采用100 g·L-1水合氯醛溶液按照3 mL·kg-1腹腔注射行全身麻醉，9 g·L-1生理鹽水及40 g·L-1多聚甲醛溶液灌注固定，斷頭取腦，剪除顱骨外軟組織，完整取出大腦組織，置入40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，在視交叉后海馬區(qū)行連續(xù)冠狀切片，切片厚度為4 μm，將切片在37 ℃單蒸水中撈于多聚賴氨酸玻片上，置于58～60 ℃ 烤箱中干燥3 h后取出。切片經(jīng)尼氏染色后在光學(xué)顯微鏡于400倍視野下觀察各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

1.3.3免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3和HSP70蛋白表達(dá)取各組大鼠海馬組織，按照免疫組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行脫蠟、水化、去離子水孵育、滴加一抗、滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、DAB顯色，其中正常對照組不加一抗，以 0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液代替一抗。每只大鼠隨機選擇2張切片，每個切片選定CA3區(qū)的任意3個高倍視野(400倍)。陽性結(jié)果判斷：Caspase-3和HSP70陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。利用Imagepro-plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量分析每個視野中Caspase-3和HSP70陽性細(xì)胞數(shù)目及平均吸光度值。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)正常對照組大鼠均無癇性發(fā)作。模型組、拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠在給予戊四氮腹腔注射后3～7 min出現(xiàn)濕狗樣抖動，面肌痙攣、眨眼、動須、面部抽搐，直至出現(xiàn)3次Ⅳ級及其以上發(fā)作。全部點燃后，模型組大鼠在腹腔注射戊四氮后1～3 min即出現(xiàn)面部及頸部肌肉痙攣、雙側(cè)前肢痙攣、全身痙攣及摔倒，部分發(fā)作形式表現(xiàn)為口鼻青紫、流出血性泡沫、強直陣攣，癇性發(fā)作達(dá)到 Ⅳ～Ⅴ級。拉莫三嗪各劑量組大鼠在腹腔注射戊四氮后5～8 min出現(xiàn)眨眼、節(jié)律性咀嚼、動須、一側(cè)前肢痙攣、雙側(cè)前肢痙攣伴伸直站立等，多表現(xiàn)為 Ⅲ～Ⅳ 級，個別發(fā)作表現(xiàn)為 Ⅴ 級，但未出現(xiàn)全身陣攣強制發(fā)作。模型組及拉莫三嗪低、中、高劑量組分別有14、18、16、18只大鼠造模成功。

2.2各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常對照組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，呈錐體形、梭形、三角形、長條形或多邊形，細(xì)胞核多為橢圓形，淡染，細(xì)胞質(zhì)染色清晰，齒狀回(dentategyrus，DG)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密度大，形態(tài)規(guī)則，排列整齊，為均勻紫藍(lán)色，尼氏小體著藍(lán)色，未見明顯丟失(圖1A)。模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元腫脹，包膜皺縮，形態(tài)不規(guī)則，無層次感，密度增大，細(xì)胞核染色不均勻，大小不一，胞內(nèi)尼氏小體明顯減少，部分神經(jīng)元丟失(圖1B)。拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元皺縮，體積縮小，DG區(qū)可見雜亂排列的神經(jīng)元細(xì)胞，與周圍組織有脫離，核深染，有核固縮、分裂及核溶解，具有凋亡特征，損傷細(xì)胞外可見多數(shù)細(xì)胞質(zhì)呈水腫性空泡狀(圖1C～E)。

A：正常對照組；B：模型組；C：拉莫三嗪低劑量組；D：拉莫三嗪中劑量組；E：拉莫三嗪高劑量組。

圖1各組大鼠海馬組織形態(tài)(尼氏染色，×400)

Fig.1Hippocampalmorphologyofratsineachgroup(Nisslstaining，×400)

2.3各組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3和HSP70陽性細(xì)胞數(shù)比較結(jié)果見圖2、圖3和表1。與正常對照組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3和HSP70陽性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.01)；拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均少于模型組，HSP70陽性細(xì)胞數(shù)均高于模型組(P<0.05)；拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加而減少，HSP70陽性細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加而增加，拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3、HSP70陽性細(xì)胞數(shù)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：正常對照組；B：模型組；C：拉莫三嗪低劑量組；D：拉莫三嗪中劑量組；E：拉莫三嗪高劑量組。

圖2各組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)(DAB，×400)

Fig.2ExpressionsofCaspase-3proteininCA3zoneofhippocampusofratsineachgroup(DAB，×400)

A：正常對照組；B：模型組；C：拉莫三嗪低劑量組；D：拉莫三嗪中劑量組；E：拉莫三嗪高劑量組。

圖3各組大鼠海馬CA3區(qū)HSP70蛋白表達(dá)(DAB，×400)

Fig.3ExpressionsofHSP70proteininCA3zoneofhippocampusofratsineachgroup(DAB，×400)

表1各組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3和HSP70陽性細(xì)胞數(shù)比較

組別nCaspase?3陽性細(xì)胞數(shù)HSP70陽性細(xì)胞數(shù)正常對照組207．40±3．25 3．20±2．58 模型組1433．20±3．94a19．50±4．03a拉莫三嗪低劑量組1830．00±1．83b21．20±3．49b拉莫三嗪中劑量組1627．00±3．40bc23．10±3．73bc拉莫三嗪高劑量組1821．20±4．52bcd26．10±4．15bcd

注：與正常對照組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05；與拉莫三嗪低劑量組比較cP<0.05；與拉莫三嗪中劑量組比較dP<0.05。

2.4各組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3和HSP70蛋白表達(dá)比較結(jié)果見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3及HSP70蛋白表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。拉莫三嗪低、中、高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)低于模型組，HSP70蛋白表達(dá)高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3蛋白的表達(dá)隨著劑量的增加而降低，HSP70蛋白表達(dá)隨著劑量的增加而增加，拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3、HSP70蛋白的表達(dá)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2各組大鼠海馬CA3區(qū)Caspase-3和HSP70蛋白表達(dá)比較

組別nCaspase?3蛋白表達(dá)HSP70蛋白表達(dá)正常對照組200．321±0．045 0．256±0．022 模型組140．546±0．081a0．309±0．019a拉莫三嗪低劑量組180．484±0．049b0．379±0．056b拉莫三嗪中劑量組160．462±0．050bc0．428±0．055bc拉莫三嗪高劑量組180．377±0．523bcd0．484±0．090bcd

注：與正常對照組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05；與拉莫三嗪低劑量組比較cP<0.05；與拉莫三嗪中劑量組比較dP<0.05。

3 討論

癲癇是兒童神經(jīng)科的多發(fā)病，嚴(yán)重危害兒童的身心健康。拉莫三嗪作為廣譜的新型抗癲癇藥物，具有抗癲癇以及神經(jīng)保護(hù)雙重作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。癲癇反復(fù)發(fā)作所致的腦部不可逆性損傷一直是人們研究的焦點。目前，點燃動物模型主要分為急性點燃動物模型和慢性點燃動物模型[6]。劉智良等[7]研究證明，慢性點燃效應(yīng)最符合人類癲癇發(fā)生機制。本實驗采用不具有神經(jīng)毒性的戊四氮制作慢性點燃癲癇大鼠模型，通過尼氏染色發(fā)現(xiàn)，模型組及拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元皺縮、核分裂及核溶解，具有凋亡特征。經(jīng)拉莫三嗪干預(yù)后損傷神經(jīng)元較模型組減少，證實拉莫三嗪對癲癇損傷的腦功能改善作用與阻止神經(jīng)元死亡及維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。

癇性發(fā)作可造成大量神經(jīng)元凋亡，在神經(jīng)元凋亡的級聯(lián)反應(yīng)中，Caspases家族發(fā)揮了重要作用，其中Caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶[8-12]，被稱為死亡蛋白。KRAJEWSKA等[13]發(fā)現(xiàn)，在腦損傷大鼠海馬組織內(nèi)存在大量表達(dá)的Caspase-3及凋亡神經(jīng)元，推測Caspase-3可能在癲癇發(fā)作時表達(dá)增加，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終使海馬神經(jīng)元凋亡。而有研究顯示，HSP70的神經(jīng)保護(hù)作用主要表現(xiàn)在抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，并阻止Caspase-3活化[14]，從而起到抗凋亡作用，通過對戊四氮制作的大鼠癲癇模型的研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后海馬區(qū)HSP70表達(dá)增加[15]。本研究觀察到正常對照組大鼠海馬Caspase-3和HSP70蛋白均呈低表達(dá)，模型組大鼠海馬Caspase-3和HSP70在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)量開始較正常對照組增多，說明處于癲癇狀態(tài)下，死亡蛋白Caspase-3和保護(hù)性蛋白HSP70表達(dá)均增多，拉莫三嗪低、中、高劑量組大鼠隨著拉莫三嗪劑量逐漸增大，Caspase-3表達(dá)逐漸降低，HSP70表達(dá)逐漸增多，推測拉莫三嗪可能在癲癇發(fā)生過程中通過降低Caspase-3的表達(dá)、增加HSP70的表達(dá)來減少神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。拉莫三嗪可以降低癲癇大鼠海馬Caspase-3的表達(dá)、增加HSP70的表達(dá)，減輕癲癇發(fā)作后大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，對戊四氮致癇大鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。隨著拉莫三嗪劑量的增加，Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸降低，HSP70蛋白表達(dá)逐漸增多，說明拉莫三嗪對戊四氮致癇大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用隨著劑量的增加而增強。

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