Vaspin通過胰島素信號(hào)通路改善地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗

劉 萍，農(nóng)晰婷，劉曉霞，張 薇，武金娥，周 鑫，成淑英，孫超峰

(1. 西安市第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710018；西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710003；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710061)

胰島素抵抗是代謝綜合征、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的共同病理生理改變。在胰島素信號(hào)通路中，主要和糖代謝相關(guān)的是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路。胰島素是糖、脂肪代謝的主要調(diào)控激素，在機(jī)體的主要靶器官是肝臟、脂肪和骨骼肌細(xì)胞，上述信號(hào)通路傳導(dǎo)發(fā)生障礙，將導(dǎo)致葡萄糖利用降低，糖原合成減少，導(dǎo)致機(jī)體胰島素抵抗。

脂肪組織是胰島素抵抗發(fā)生的一個(gè)重要部位，脂肪組織不僅參與能量代謝，而且是特殊的內(nèi)分泌器官[1]，可分泌多種細(xì)胞及組織因子，來自脂肪組織的細(xì)胞因子對(duì)胰島素抵抗的發(fā)生有重要作用[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由它產(chǎn)生的許多細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)等途徑參與胰島素抵抗及其相關(guān)疾病，如代謝綜合征、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。

Vaspin(visceral adipose tissue-derived serineprotease inhibitor)為內(nèi)臟脂肪組織特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，是日本學(xué)者HIDA等[5]在2005年首先從T2DM肥胖大鼠(OLETF大鼠)內(nèi)臟脂肪組織中分泌出來的新的脂肪因子。在肥胖的大鼠或是人的脂肪組織中Vaspin的表達(dá)均明顯增高，在肥胖和胰島素抵抗的人血清中Vaspin的濃度也明顯增加[6-7]。大量研究表明，Vaspin具有改善胰島素敏感性，調(diào)節(jié)糖、脂代謝及抑制炎性因子的作用[8]，但是Vaspin如何調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)糖脂代謝、增加胰島素敏感性，具體作用機(jī)制還不明確。

1 材料與方法

1.13T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。取3代左右的3T3-L1前脂肪細(xì)胞種在6孔板上，待細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)至完全匯合并達(dá)到相互接觸抑制后2 d，更換培養(yǎng)基為含有異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)0.5 mmol/L(Sigma-Aldrich, USA)、地塞米松1 μmol/L(Sigma-Aldrich, USA)和胰島素10 μg/mL(Sigma-Aldrich, USA)誘導(dǎo)劑及100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。2 d后，更換誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基為含有100 mL/L胎牛血清和胰島素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隨后2 d換為僅含有100 mL/L 胎牛血清的完全培養(yǎng)基，每2 d換液一次。繼續(xù)培養(yǎng)4 d(即誘導(dǎo)分化8 d)。在8 d后，90%以上的細(xì)胞都分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

1.2Westernblot法檢測(cè)Vaspin對(duì)成熟脂肪細(xì)胞PAKT/AKT通路的影響分化成熟的脂肪細(xì)胞在含有20 mL/L胎牛血清高糖DMEM中培養(yǎng)6 h。將成熟脂肪細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、Vaspin(PEPROTECH USA)50 ng/mL組、Vaspin 100 ng/mL組、Vaspin 200 ng/mL組，培養(yǎng)12 h收取細(xì)胞，Western blot檢測(cè)PAKT/AKT變化。

1.3胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 分化成熟的脂肪細(xì)胞同步化6 h，將成熟脂肪細(xì)胞分為對(duì)照組和地塞米松處理組。地塞米松處理組細(xì)胞：將培養(yǎng)基更換為含有1 μmol/L地塞米松和100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)到48 h；對(duì)照組細(xì)胞更換為僅含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM，同時(shí)設(shè)立未接種細(xì)胞的空白對(duì)照，加入等體積的DMEM高糖培養(yǎng)基。分別收集24、48 h各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度，所得濃度與未接種細(xì)胞的DMEM高糖培養(yǎng)基的葡萄糖濃度相減，得出各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 分化成熟的脂肪細(xì)胞同步化6 h，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Vaspin 200 ng/mL+wortmannin 100 nmol/L組。①對(duì)照組：不建模，為100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)；②模型對(duì)照組：建模不干預(yù)，含有1 μmol/L地塞米松和100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)；③實(shí)驗(yàn)組：建模同時(shí)，Vaspin 200 ng/mL干預(yù)24 h；④Vaspin 200 ng/mL+wortmannin 100 nmol/L組，用wortmannin 100 nmol/L預(yù)處理30 min，建模同時(shí)，Vaspin 200 ng/mL干預(yù)24 h。

1.4細(xì)胞鑒定和檢測(cè)

1.4.1成熟脂肪細(xì)胞的鑒定-油紅O染色 將已經(jīng)誘導(dǎo)分化成的3T3-L1脂肪細(xì)胞6孔板用PBS輕輕振蕩洗滌2次，加入40 g/L多聚甲醛溶液，固定30 min，PBS緩沖液洗凈，用油紅O工作液，加入到固定好的脂肪細(xì)胞中，共同孵育2 h，PBS緩沖液洗至使其背景透明，胞質(zhì)中脂滴被特異性的染為亮紅色。

1.4.2各組細(xì)胞葡萄糖消耗量測(cè)定 分別于分組處理后第24、48、72 h，每孔吸取100 μL上清液，分別收集24、48、72 h各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度，所得濃度與未接種細(xì)胞的DMEM高糖培養(yǎng)基的葡萄糖濃度相減，得出各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.4.3IRS-1、PI3K、phospho-Akt、Akt蛋白表達(dá)及磷酸化蛋白測(cè)定 采用Western blot檢測(cè)IRS-1、PI3K、phospho-Akt、Akt蛋白表達(dá)。收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞裂解，磷酸化蛋白按1∶50加入磷酸酶抑制劑復(fù)合物，進(jìn)行蛋白定量(BCA Protein Assay Kit)。取20 μg蛋白樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含有50 mL/L牛血清白蛋白的TBST室溫封閉膜2 h，膜分別與兔來源的多克隆PI3K一抗(1∶2 000，EPITOMICS, USA)、phospho-473-Akt一抗(1∶1 000，EPITOMICS, USA)、Akt一抗(1∶1 000，EPITOMICS, USA)及IRS-1一抗(1∶2 000，Cell Signaling Technology, USA)4 ℃孵育過夜；1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(EPITOMICS, USA)室溫孵育2 h；將膜蛋白面朝下，與發(fā)光液避光充分反應(yīng)5 min，根據(jù)Quantity One圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行測(cè)定，分析蛋白表達(dá)的相對(duì)量，計(jì)算灰度值，并與內(nèi)參β-actin比對(duì)，校正蛋白定量等實(shí)驗(yàn)誤差。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞鑒定的結(jié)果3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞，油紅O染色鑒定，3T3-L1前脂肪細(xì)胞成功分化為成熟脂肪細(xì)胞(圖1)。

2.2地塞米松誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗用1 μmol/L地塞米松作用于分化成熟的脂肪細(xì)胞，24、48 h通過葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，地塞米松作用使葡萄糖消耗量下降，24 h葡萄糖消耗量下降19.6%，48 h葡萄糖消耗量下降26.4%(圖2)。成功建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。

圖1脂肪細(xì)胞的鑒定

Fig.1 Identification of 3T3-L1 adipocytes (×200)

A：3T3-L1前脂肪細(xì)胞；B：油紅O染色分化成熟的脂肪細(xì)胞。

圖21μmol/L地塞米松作用3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖消耗量的影響

Fig.2 Effect of 1 μmol/L dexamethasone on glucose consumption of mature adipocytes

與對(duì)照組相比，**P<0.01。

2.3不同濃度Vaspin對(duì)成熟脂肪細(xì)胞PAKT/AKT通路的影響為了解Vaspin對(duì)成熟脂肪細(xì)胞PAKT/AKT通路的影響，我們用Vaspin(0、50、100、200 ng/mL)干預(yù)成熟脂肪細(xì)胞12 h，Western blot檢測(cè)PAKT/AKT的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，PAKT隨Vaspin濃度增加，表達(dá)增強(qiáng)，在50 ng/mL與對(duì)照相比沒有明顯差異，在100、200 ng/mL均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，圖3)。

2.4各組成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗量對(duì)照組、模型對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分組處理后24、48、72 h，24、48 h模型對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較，實(shí)驗(yàn)組葡萄糖消耗量均高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72 h實(shí)驗(yàn)組葡萄糖消耗量也高于模型對(duì)照組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24、48、72 h對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較，葡萄糖消耗量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖4)。

2.5Vaspin對(duì)各組3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)通路PAKT/AKT、PI3K、IRS-1蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的IRS-1、PI3K、PAKT的蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組IRS-1、PI3K、PAKT的蛋白表達(dá)量均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；wortmannin預(yù)處理則阻斷了Vaspin對(duì)PAKT/AKT、PI3K、IRS-1的蛋白表達(dá)的上調(diào)(圖5)。

圖3不同濃度Vaspin對(duì)成熟脂肪細(xì)胞PAKT/AKT通路的影響

Fig.3 Effects of different concentrations of Vaspin on PAKT/AKT pathway of mature adipocytes

與對(duì)照組相比，**P<0.01。

圖4各組3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗量

Fig.4 Glucose consumption of adipocytes in different groups

模型對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05。

圖5各組3T3-L1脂肪細(xì)胞PAKT/AKT、PI3K、IRS-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

Fig.5 The relative expressions of PAKT/AKT, PI3K and IRS-1 protein in different groups of adipocytes

圖中柱形及所對(duì)應(yīng)的條帶依次為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、模型對(duì)照組及Vaspin+wortmannin組。實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，##P<0.01；對(duì)照組與模型對(duì)照組相比，**P<0.01；實(shí)驗(yàn)組與Vaspin+wortmannin組相比，△△P<0.01。

3 討 論

脂肪組織在胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。不僅脂肪組織在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)，作為一個(gè)內(nèi)分泌器官，其分泌的脂肪因子參與整個(gè)機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)。研究認(rèn)為：肥胖和胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)。胰島素抵抗被視為2型糖尿病、肥胖、血脂異常、高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化的共同危險(xiǎn)因素。

Vaspin作為一個(gè)新的脂肪因子，由于抑制抵抗素、瘦素及TNF-α等前脂肪因子的表達(dá)，明顯改善OLETF大鼠的胰島素敏感性，因此Vaspin被認(rèn)為是一個(gè)有胰島素增敏作用的脂肪因子[5,7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖、T2DM等代謝綜合征的胰島素抵抗患者體內(nèi)Vaspin水平明顯高于非胰島素抵抗者，血清中Vaspin水平被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)胰島素抵抗的一種代償性改變；通過改善患者體內(nèi)胰島素抵抗后血漿Vaspin水平也明顯降低，血漿Vaspin水平與胰島素抵抗呈正相關(guān)[9-10]。Vaspin可能延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[10]。JUNG等[11]研究發(fā)現(xiàn)Vaspin能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)通路PI3K/Akt，激活PI3K激酶，增加PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt的磷酸化水平，并抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，Vaspin可能通過改善胰島素敏感性，進(jìn)一步改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。此外，Vaspin通過阻止氧化應(yīng)激減弱了高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖和激活，抑制了高糖誘導(dǎo)的MAPK、PI3K/Akt胰島素受體信號(hào)以及核因子-KB信號(hào)通路[12]。目前，Vaspin在脂肪細(xì)胞特別是對(duì)于胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞的研究甚少。

脂肪細(xì)胞是胰島素抵抗發(fā)生的一個(gè)重要部位。王麗靜等[13]用不同濃度地塞米松(10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L)與成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞孵育，結(jié)果顯示地塞米松明顯抑制脂肪細(xì)胞糖攝取，其中1 μmol/L地塞米松抑制葡萄糖利用率達(dá)到80%。本實(shí)驗(yàn)利用3T3-L1脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，研究Vaspin對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用及其可能的機(jī)制。為了模擬脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，我們用1 μmol/L地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。

胰島素通過胰島素信號(hào)通路IRS/PI3K/AKT介導(dǎo)其糖代謝調(diào)節(jié)作用。IRS上磷酸化的酪氨酸殘基與PI3K相互作用，PI3K能催化二磷酸磷脂酰肌醇為三磷酸磷脂酰肌醇，PI3K/Akt的激活促進(jìn)GLUT4從胞質(zhì)向胞膜轉(zhuǎn)位，位于胞膜上的GLUT4可將細(xì)胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，因此這一通路的活化將使細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取增加。上述信號(hào)通路傳導(dǎo)發(fā)生障礙，將導(dǎo)致脂肪、肌肉等組織產(chǎn)生胰島素抵抗。我們觀察了Vaspin對(duì)成熟脂肪細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，Vaspin能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)磷酸化AKT蛋白的表達(dá)，并呈劑量依賴性。為研究Vaspin在體外對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞的作用，特別是脂肪細(xì)胞，我們成功構(gòu)建了地塞米松誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。用200 ng/mL Vaspin干預(yù)胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞，可以看出，在24、48 h葡萄糖的消耗量與模型對(duì)照組相比明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Vaspin抑制了地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抵抗。本研究用1 μmol/L地塞米松處理脂肪細(xì)胞，觀察到胰島素信號(hào)通路中IRS-1蛋白表達(dá)約抑制68%，PI3K約抑制69%，PAKT約抑制79%；通過Vaspin干預(yù)地塞米松誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞，可以看出Vaspin減弱了胰島素信號(hào)通路中IRS-1、PI3K、PAKT地塞米松的抑制作用，與模型對(duì)照組相比，胰島素信號(hào)通路中的蛋白均上調(diào)，推測(cè)Vaspin引起的上述改變可能與PI3K/Akt通路有關(guān)；通過使用PI3K的特異性抑制劑wortmannin預(yù)處理后再給予Vaspin，發(fā)現(xiàn)IRS-1、PI3K、PAKT明顯被抑制，進(jìn)一步提示Vaspin改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗可能是通過IRS-1/PI3K/Akt通路。

綜上所述，本研究證實(shí)：Vaspin通過IRS-1/PI3K/Akt通路，增加了地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖消耗，提示Vaspin可能影響胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞中胰島素信號(hào)通路IRS-1、PI3K、PAKT的蛋白表達(dá)，增加葡萄糖的利用，從而改善胰島素抵抗。因此，Vaspin可能作為很有潛力的治療2型糖尿病的藥物將被進(jìn)一步研究。

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