中藥健脾方對(duì)糖尿病大鼠腎組織骨橋蛋白及腎臟病理的影響

邢艷陽(yáng)，李中南，邢宇婷，竇德梅

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

糖尿病腎病(DKD)是糖尿病(DM)常見(jiàn)的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，20%～40%的糖尿病患者發(fā)展成慢性腎臟病，是糖尿病患者腎衰竭的主要原因[1]。骨橋蛋白(OPN)是一種具有細(xì)胞粘附和遷移功能的分泌型磷酸化糖蛋白，可作為腎小管間質(zhì)的一種重要趨化因子，通過(guò)介導(dǎo)該部位的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白尿漏出、腎小球硬化等機(jī)制促進(jìn)DKD的發(fā)生與發(fā)展[2]。降低糖尿病腎病骨橋蛋白的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞驅(qū)化，改善早期腎臟病變程度，是延緩糖尿病腎損害的一個(gè)新途徑[3]。本次實(shí)驗(yàn)旨在研究中藥健脾方對(duì)糖尿病大鼠腎組織OPN的表達(dá)及對(duì)腎臟病理的影響，分析討論健脾活血中藥對(duì)腎臟的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取正常雄性大鼠50只，體質(zhì)量(190±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)，合格證號(hào)：0001841。飼養(yǎng)房空氣流通，溫度維持在18～25 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%，動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物與試劑 中藥健脾方由黃芪20 g、山藥15 g、白術(shù)10 g、茯苓10 g、生地10 g、丹參15 g、菝葜15 g、地龍10 g、五味子5 g、黃連10 g組成，飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供；鹽酸吡咯列酮(杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):H20050500)；鏈脲佐菌素(STZ)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S0130)；水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司生產(chǎn)，批號(hào):H3702673)；通用型二抗試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：131208K)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 血糖監(jiān)測(cè)儀(美國(guó)強(qiáng)生公司，型號(hào)：穩(wěn)豪型)；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)；全自動(dòng)生化儀(日本株式會(huì)社，型號(hào):日立 7600)。

1.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù)與分組 將50只健康雄性大鼠予基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)16%，碳水化合物50%，脂肪8%)飼喂1周，隨機(jī)抽取10只作為健康對(duì)照組，其余大鼠作實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組予基礎(chǔ)飼料飼喂至本實(shí)驗(yàn)終止；實(shí)驗(yàn)組予高脂飼料(其中蛋白質(zhì)15%，脂肪25%，碳水化合物45%，膽固醇5%，豬油10%)喂養(yǎng)，4周后造模，禁食8 h后，將STZ用0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH值為4.4)配成2%濃度，按35 mg/kg劑量于大鼠左下腹一次性腹腔注射，120 h后取鼠尾靜脈測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L視為造模成功。將造模失敗的5只大鼠剔去，成模的45只大鼠隨機(jī)分成模型組11只，中藥組12只，吡格列酮組12只。按人與鼠的單位體質(zhì)量折算系數(shù)算出各組的藥用劑量，其中中藥組按3 g·kg-1·d-1予健脾方灌胃，吡格列酮組按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康對(duì)照組和模型組按5 mL·kg-1·d-1予0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組持續(xù)飼喂8周直至本實(shí)驗(yàn)完成。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法 連續(xù)灌胃，分別在第2、4周末測(cè)定各組大鼠血糖并記錄，8周末測(cè)定血糖及血脂[低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)]，禁食不禁水8 h，再以3%水合氯醛按10 mg/kg給大鼠腹腔注射麻醉，迅速分離雙腎，將新鮮組織放在凍存管內(nèi)，并保存于液氮中，按免疫組織化學(xué)法操作標(biāo)準(zhǔn)完成。采取JD801形態(tài)分析系統(tǒng)分析腎組織OPN的表達(dá)圖，以陽(yáng)性面積及平均吸光度來(lái)表示OPN的表達(dá)強(qiáng)度。高倍鏡(×400)下觀察并記錄切片中腎組織不重疊視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。病理切片采取HE染色法，光鏡下觀察并比較腎組織病理學(xué)變化程度。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間模型組、吡格列酮組、中藥組因血糖過(guò)高各死亡1只，兩藥物組因大鼠打斗各死亡1只。

2.1 各組大鼠腎組織OPN的比較 高倍鏡觀察顯示：正常組大鼠OPN在腎組織中未見(jiàn)明顯表達(dá)；模型組OPN的表達(dá)較正常組顯著升高，多呈強(qiáng)陽(yáng)性，尤其以腎小管與腎間質(zhì)細(xì)胞中較明顯；與模型組對(duì)比，中藥組、吡格列酮組大鼠腎組織中OPN的表達(dá)有不同程度的下降，多呈弱陽(yáng)性，差異較為明顯。

與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織OPN的陽(yáng)性面積、平均吸光度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，中藥組和吡咯列酮組OPN陽(yáng)性面積、平均吸光度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01或P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1，表1。

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)的改變 光鏡觀察顯示：正常組大鼠腎組織形態(tài)規(guī)則，腎小球結(jié)構(gòu)完整，基底膜較薄，腎小管形態(tài)完整清晰，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同正常組比較，模型組大鼠腎組織形態(tài)欠規(guī)則，毛細(xì)血管袢結(jié)構(gòu)不清晰，腎小球體積顯著增大，可見(jiàn)腎小球囊腔增大、結(jié)構(gòu)不規(guī)整，基底膜增厚，腎小管部分萎縮、部分?jǐn)U張，間質(zhì)血管有不同程度的增生，細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多，腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同模型組比較，中藥組、吡格列酮組大鼠腎組織病變有不同程度的改善，腎小球結(jié)構(gòu)清晰、規(guī)則，基膜增厚減輕，可見(jiàn)部分腎小球體積增大，腎小管腔輕度擴(kuò)張，腎小球內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目稍增多，細(xì)胞外基質(zhì)增多降低，腎間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)少許的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠腎組織中OPN陽(yáng)性面積、平均吸光度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

2.3 各組大鼠血糖、血脂的比較 與正常組相比，模型組各時(shí)段血糖、血脂(TG、TC、LDL-C)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥組和吡格列酮組血糖及血脂水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2，3。

表2 各組大鼠血脂的比較

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

表3 各組大鼠不同時(shí)段血糖的比較

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

3 討論

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DKD的發(fā)病機(jī)制為糖脂代謝紊亂、遺傳易患性、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等多種因素共同作用，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多、基膜變厚、微血管病變、腎組織纖維化等病理變化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，OPN大量表達(dá)于腎臟及骨骼中，腎組織中OPN可由腎小管上皮細(xì)胞合成、分泌，高糖可誘導(dǎo)OPN合成增加[5]。腎組織OPN進(jìn)一步介入到巨噬細(xì)胞趨化、蛋白尿滲出及腎小球硬化等多個(gè)環(huán)節(jié)，促使DKD的發(fā)生與發(fā)展。故早期阻斷腎組織中OPN的表達(dá)，對(duì)DKD的治療有重要意義[6-7]。

本次實(shí)驗(yàn)注意到模型組大鼠腎組織OPN的表達(dá)明顯增加，多呈強(qiáng)陽(yáng)性。中藥組大鼠腎組織OPN的表達(dá)顯著下降，多數(shù)不表達(dá)或呈弱陽(yáng)性表達(dá)。同時(shí)，提示模型組大鼠腎組織OPN的陽(yáng)性面積、平均吸光度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加；中藥組和吡咯列酮組上述指標(biāo)明顯下降，表明中藥健脾方可顯著抑制OPN的表達(dá)。腎臟病理結(jié)果提示，模型組大鼠腎臟受損較為嚴(yán)重，予中藥健脾方治療后大鼠腎組織病變明顯減輕，提示本方可減輕糖尿病大鼠腎臟病理?yè)p傷，對(duì)腎臟早期損傷具有良好的保護(hù)作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出模型組大鼠的血糖、TC、TG等水平顯著增高，予中藥健脾方后大鼠的血糖、血脂水平較模型組明顯降低。分析本方的作用機(jī)制，可能是通過(guò)減少炎性因子的刺激，減輕糖脂毒性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害，進(jìn)而降低腎組織OPN的高表達(dá)，減緩腎臟的病理?yè)p害，抑制DKD的進(jìn)展。

A1：健康對(duì)照組；B1：模型組；C1：中藥組；D1：吡格列酮組

A2：健康對(duì)照組；B2：模型組；C2：中藥組；D2：吡格列酮組

近幾年，課題組從臨床調(diào)查入手，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者中脾虛血瘀型增多。如名老中醫(yī)曹恩澤主任認(rèn)為，脾腎虧虛是DKD的病理基礎(chǔ)，瘀血是DKD發(fā)病的重要病理因素[8]。糖尿病腎病雖病本在腎，但與脾胃關(guān)系密切。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾胃為乃后天之本，氣血生化之源；腎是先天之本，為精血之海，生命之根[9-10]。脾腎二臟在生理上相互滋生，在病理上亦互為因果，彼此影響。同時(shí)，“久病入絡(luò)”“久病致瘀”，瘀血阻絡(luò)貫穿著DKD的始終，既是DKD的病理產(chǎn)物，又可作為其致病因素。故治療糖尿病腎病應(yīng)注意調(diào)養(yǎng)脾腎，活血化瘀。本實(shí)驗(yàn)選擇健脾益氣活血方符合臨床實(shí)際。方中黃芪、白術(shù)、茯苓益氣健脾利濕，山藥健脾補(bǔ)腎，養(yǎng)胃生津；生地清熱涼血，滋腎養(yǎng)陰；黃連清熱燥濕解毒；丹參活血祛瘀，五味子滋腎生津，菝葜健脾利濕解毒，地龍活血通絡(luò)、捜剔驅(qū)邪。諸藥合用，達(dá)到健脾補(bǔ)腎，益氣活血之效，全方陰陽(yáng)互濟(jì)，攻補(bǔ)兼施，扶正祛邪，使機(jī)體陰陽(yáng)平，瘀濁去，腎絡(luò)通。

藥理研究證實(shí)，丹參、黃芪等能夠降低血糖和改善胰島素抵抗(IR)[11-12]；黃芪甲苷能夠修復(fù)高糖誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙，故能在一定程度上保護(hù)糖尿病血管重構(gòu)[13]，且黃芪通過(guò)減少腎臟局部TGF-β1、OPN的表達(dá)和巨噬細(xì)胞驅(qū)化，減輕組織損傷，保護(hù)腎臟功能，對(duì)患者整體起著矯正蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂的作用；丹參可明顯下調(diào)腎臟OPN的合成與分泌[14]；黃連中的小檗堿能增強(qiáng)胰島素的敏感性，且能下調(diào)血清中游離脂肪酸，改善大鼠的高糖高脂狀態(tài)，調(diào)節(jié)胰島素分泌及改善IR[15]。山藥多糖對(duì)胰島細(xì)胞起到保護(hù)和修復(fù)作用，并能降低胰高血糖素的水平，使胰島素的分泌增加[16]；白術(shù)能夠減輕四氧嘧啶損害胰島B細(xì)胞，或能改善胰島B細(xì)胞功能，達(dá)到降糖效果[17]；茯苓多糖能顯著升高2型糖尿病小鼠腎臟中超氧化物岐化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的水平，減少丙二醛的含量，增強(qiáng)腎組織的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，改善自由基所致氧化損傷，抑制T2DM小鼠腎臟中Bax基因的表達(dá)，進(jìn)而減緩腎組織細(xì)胞凋亡趨勢(shì)，保護(hù)腎臟[18]；地龍能改善DKD患者的脂質(zhì)代謝紊亂，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，清除氧自由基，降低過(guò)氧化脂質(zhì)水平[19]；生地黃、北五味子可增強(qiáng)抗氧化能力、加速自由基的清除[20]。菝葜提取物對(duì)于小鼠蛋清致足腫、醋酸致腹膜炎等有良好的抗炎、消腫作用，大大降低炎癥部位的炎癥介質(zhì)，并有不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用[21]。

綜上所述，中藥健脾方可能是通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)提高機(jī)體免疫功能，減少炎性反應(yīng)，清除氧自由基，改善血液高粘、高聚狀態(tài)，抑制糖尿病腎臟病理炎癥狀態(tài)，調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，降低腎臟骨橋蛋白的高表達(dá)，從而起到延緩糖尿病腎臟損傷，保護(hù)腎臟功能的作用。

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