SFRP1蛋白在前列腺腺癌中的表達及意義

張麗 何洪敏 張楠

前列腺腺癌是一類嚴重危害男性健康的疾病，在過去幾十年中，前列腺腺癌的發(fā)病人數(shù)持續(xù)上升。其發(fā)生發(fā)展是一個長期的、多因素的復雜的過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路及其抑制劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（Secreted Frizzled-related Proteins 1，SFRP1）與前列腺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wnt信號通路由Wnts基因調(diào)控，通過Wnt相關(guān)蛋白與其位于細胞表面的受體結(jié)合來完成對細胞間生長、發(fā)育信號的轉(zhuǎn)導和調(diào)控[1]。Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白及調(diào)控蛋白在多種不同的前列腺癌細胞中存在著表達差異[2]。Thiele等[3]在前列腺癌細胞株中對SFRP1從mRNA水平進行了相關(guān)的研究。Wnt信號通路中涉及很多因子，而作為SFRP家族成員之一的SFRP1是Wnt信號通路的負性調(diào)節(jié)劑，它通過干擾配體和受體間的相互作用而阻斷Wnt信號通路[4]。目前國內(nèi)外有關(guān)SFRP1蛋白在前列腺腺癌中研究報道較少，本研究應用免疫組化PV二步法分別檢測52例前列腺腺癌和68例良性前列腺增生組織中SFRP1蛋白的表達情況，并分析其與前列腺腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，以探討其在前列腺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年1月-2016年10月棗莊市立醫(yī)院病理科存檔的經(jīng)穿刺、電切或手術(shù)切除的男性前列腺腺癌石蠟包埋組織52例。每例標本均經(jīng)兩名主治醫(yī)師及以上的病理醫(yī)師閱片確認。患者年齡53～82歲，中位年齡68歲；術(shù)前血清PSA值18.6～100 ng/mL，平均（58.6±27.4）ng/mL；所有患者術(shù)前均未進行放化療及內(nèi)分泌治療；Gleason評分5～6分（中分化）17例，Gleason評分7～10分（低分化）35例；根據(jù)WHO的TNM分期，Ⅰ期+Ⅱ期（T1、T2期）23例，Ⅲ期+Ⅳ期（T3、T4期）29例；有骨轉(zhuǎn)移者18例，無骨轉(zhuǎn)移者34例。選取同期存檔的68例經(jīng)病理診斷及免疫組化證實的良性前列腺增生的石蠟包埋組織做對照。

1.2 主要試劑 兔抗人SFRP1多克隆抗體購自美國santa cruz公司（工作濃度為1∶100），PV-9000檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉公司。

1.3 方法 采用免疫組織化學PV-9000兩步法，所有蠟塊進行厚4 μm的切片后脫蠟至水。后滴加3%H2O2室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性。經(jīng)抗原熱修復后，室溫放置自然冷卻，滴加一抗，4 ℃過夜。PBS緩沖液沖洗2 min×3次，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，置于37 ℃溫箱內(nèi)孵育20 min。PBS緩沖液沖洗2 min×3次，滴加反應增強液，置于37 ℃溫箱內(nèi)孵育30 min。PBS緩沖液沖洗2 min×3次，DAB顯色劑顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知表達陽性的切片做陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 由兩位主治醫(yī)師及以上的病理醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。判定陽性反應依據(jù)以下兩個方面：（1）按顯色強度評分：細胞無顯色為0分；細胞呈淺黃色為1分；細胞呈棕黃色為2分；細胞呈深棕褐色為3分。（2）按陽性細胞百分率評分：光鏡下隨機選取10個視野（×400倍），每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞百分率＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。SFRP1蛋白以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽性（見圖1），陰性表達見圖2。上述（1）+（2）＞3分為陽性，≤3分為陰性。

圖1 SFRP1蛋白在良性前列腺增生組織中的陽性表達（PV兩步法，×200）

圖2 SFRP1蛋白在前列腺腺癌中的陰性表達（PV兩步法，×200）

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SFRP1蛋白在前列腺腺癌及良性前列腺增生組織中的表達 SFRP1蛋白在前列腺腺癌組中的陽性表達率為23.08%（12/52），低于良性前列腺增生組織組的80.88%（55/68），差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=39.928，P＜0.001）。

2.2 SFRP1蛋白失表達與前列腺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2.1 SFRP1蛋白失表達與Gleason評分的關(guān)系 SFRP1蛋白在中分化的前列腺癌患者中的陽性表達率為41.18%（7/17）， 高 于 低 分 化 的 14.29%（5/35），差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=4.661，P=0.042）。隨著Gleason評分的增加，SFRP1陽性表達率降低，故SFRP1蛋白的失表達與前列腺腺癌Gleason評分呈負相關(guān)（P＜0.05）。

2.2.2 SFRP1蛋白失表達與年齡之間的關(guān)系 SFRP1蛋白在≤68歲前列腺癌患者中陽性表達率為26.32%（5/19），在＞68歲前列腺癌患者中陽性表達率為21.21%（7/33），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（ 字2=0.177，P=0.739）。

2.2.3 SFRP1蛋白失表達與術(shù)前血PSA值之間的關(guān)系 SFRP1蛋白在術(shù)前血PSA值≤58.6 ng/mL前列腺癌患者中的陽性表達率為30.00%（9/30），在術(shù)前血PSA值＞58.6 ng/mL的陽性表達率為13.64%（3/22），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（ 字2=1.915，P=0.200）。

2.2.4 SFRP1蛋白失表達與TNM分期之間的關(guān)系 SFRP1蛋白在Ⅰ期+Ⅱ期（T1、T2期）的前列腺癌患者中陽性表達率為17.39%（4/23），在Ⅲ期+Ⅳ期（T3、T4期）的陽性表達率為27.59%（8/29），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（ 字2=0.751，P=0.513）。

2.2.5 SFRP1蛋白失表達與骨轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系 SFRP1蛋白在有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者中陽性表達率為33.33%（6/18），在無骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者中陽性表達率為17.65%（6/34），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（ 字2=1.631，P=0.300）。

3 討論

Wnt信號通路調(diào)控著細胞增殖、分化和凋亡等諸多過程，它的異常激活與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。SFRP1基因位于染色體8p11.2區(qū)，該位點在多種腫瘤中存在缺失現(xiàn)象。它編碼的SFRP1蛋白是Wnt信號通路的負性抑制劑。SFRP1通過結(jié)構(gòu)上有同源性的CRD與Wnt信號通路的特異性受體Fz（Frizzled）受體競爭性結(jié)合而阻斷Wnt信號通路，從而起到抑癌作用[6]。

國外的一項研究表明，在結(jié)腸癌中SFRP1是一種新的腫瘤抑制基因，通過CpG島啟動子的異常甲基化而失活[7]。文獻[8]研究表明，在胃癌中SFRP1表達的降低與組織病理學分級和預后顯著相關(guān)。SFRP1基因啟動子頻繁甲基化導致SFRPl蛋白的表達沉默是Wnt通路異常引發(fā)腫瘤的可能機制[9]。目前有關(guān)前列腺腺癌組織中SFRP1蛋白的失表達情況報道較少，且意義尚不清楚。有學者做Western分析顯示，SFRP1在前列腺癌中的表達是降低的[10]。文獻[11]研究顯示，與正常的前列腺細胞株相比，在前列腺癌細胞株，SFRP家族的5個成員的表達均是明顯降低的。并且還發(fā)現(xiàn)，SFRP1基因的甲基化在PC3細胞啟動子，但不在LNCaP。

本研究應用免疫組織化學方法檢測52例前列腺腺癌及68例良性前列腺增生組織中SFRP1蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，SFRP1蛋白在前列腺腺癌組織中的陽性表達率（23.08%）顯著低于良性前列腺增生組織（80.88%）（P＜0.05）。提示SFRP1可能在抑制前列腺腺泡細胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化中起著一定作用：SFRP1基因CpG島啟動子的異常甲基化，致使SFRP1失活并蛋白表達降低，對Wnt信號通路抑制作用減弱，導致前列腺腺泡上皮的異常增殖和前列腺腺癌的發(fā)生。Lo等[12]采用了甲基化特異性PCR方法在浸潤性乳腺癌中證明了上述觀點，此外，在子宮頸癌、胃癌、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、腎細胞癌中也相繼發(fā)現(xiàn)了SFRP1啟動子的異常甲基化現(xiàn)象[13-17]。這有可能為惡性腫瘤的臨床診治和判斷預后提供一定的幫助。本研究還發(fā)現(xiàn)：SFRP1蛋白的失表達與前列腺腺癌Gleason評分呈負相關(guān)（P＜0.05），即隨著前列腺腺癌Gleason評分的增加，SFRP1蛋白表達降低；而與患者年齡、術(shù)前血PSA值、TNM分期、是否有骨轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P＞0.05），表明SFRP1可能是前列腺腺癌組織學進展的一個相關(guān)因子，SFRP1蛋白的失表達有可能參與了前列腺腺癌的組織學進展。Zheng等[18]的研究也表明：在前列腺癌和良性前列腺增生患者相比，SFRP1和β-catenin的表達率與前列腺癌的Gleason評分有關(guān)，也與患者的預后生存率和內(nèi)分泌治療有關(guān)。但這之間的具體的作用機制和對臨床的診療、預后等還需要進一步的研究。另外文獻[19]認為SFRP1在前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮一定的作用。甚至在肺腺癌中，某些藥物可以通過提升SFRP1基因的表達和改變其甲基化狀態(tài)，從而對治療起到一定作用[20]。

總之，SFRP1在前列腺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，臨床上對它們進行分子水平的檢測和研究將有可能對于前列腺腺癌的診斷、治療和預后起到一定的幫助。是否有新的藥物可以改變其甲基化狀態(tài)和表達，是否能作用于臨床，還需要進一步的研究和證實。

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